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硫胺素焦磷酸(ThDP)作为辅酶可以辅助生物体内多种代谢酶催化的反应,这些反应大多数涉及邻近羰基碳碳键的生成和断裂,由于这些酶均需要ThDP作为辅酶,故将其统称为ThDP依赖酶,其中包括丙酮酸脱羧酶(PDC),1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS),乙酰乳酸合酶(ALS),转酮酶(TK)等多种生物合成途径中的关键酶。其中DXS是新发现的2-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)萜类化合物生物合成途径的第一个关键酶,同时又是硫胺素(vitamin B1)和磷酸吡哆醇(维生素B6)生物合成途径中的关键酶。在DXS酶的催化下,一分子丙酮酸和一分子D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)缩合生成MEP途径的第一个中间体1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP),这步酶催化反应的化学机制目前尚未完全阐明,这就成为以DXS作为靶标进行新型抗菌素和抗疟药物筛选的一个很大障碍,故本研究通过同位素标记实验探索了DXS催化丙酮酸和D-GAP缩合反应的催化机制。同时,PDC催化丙酮酸的非氧化脱羧反应,即催化丙酮酸脱羧生成乙醛和C02,这步反应是丙酮酸转化为乙醇的关键步骤,本研究在对DXS催化机理探讨的基础上,探索了同为ThDP依赖酶的PDC是否通过同样的反应过程。首先,本研究通过对工程菌E. coli BL21(DE3)-RcDXS/EcDXS进行扩大培养,诱导重组酶合成,对其进行金属离子螯合亲和层析纯化,并对纯化后的重组DXS进行活性检测,可以得到纯度较高(90%)且具有很好催化活性的DXS,并将其用于DXS催化机理的进一步研究。然后,将纯化后所得到的DXS酶作为催化剂,利用同位素标记方法,结合1H-NMR,LC-ESI-MS等手段对酶反应产物DXP进行分析,初步证实反应中间体羟乙基硫胺素焦磷酸(HEThDP)应该存在三种共振结构,即文献已报道的C-2a碳负离子和烯铵结构及我们发现的第三种共振形式---烯醇式共振结构。进一步,由于DXS隶属ThDP依赖酶大家族,而目前认为所有ThDP依赖酶的催化机理有一个通用模式。为了证明我们在DXS催化过程发现的机理是否对其它ThDP依赖酶同样适用,我们以PDC作为研究对象,以同位素标记实验作为研究手段,初步证实HEThDP的第三种共振形式也存在于PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛的过程。