目的:疟疾是由疟原虫感染后直接引起的一种寄生原虫感染性疾病,对身体健康有极大的损害。在2019年由世界卫生组织（World Health Organization,WHO）出版的疟疾报告（malaria report）中显示,2018年疟疾新发病例有很大程度上的下降,但是仍然有2.28亿人是新发生的感染病例,死亡人数更是超过了40万,尤其是五岁以下的儿童,死亡超过27万。那么抗疟疾保护性疫苗的研发,就显得尤为重要,但是目前为止还没有完全有效的抗疟疾疫苗。被欧洲药品管理局批准的世界上第一个疟疾疫苗-RTS,S/AS01有效率最多50%,因此,需要充分认识疟疾免疫的特点,这对疟疾疫苗的研发设计以及疟疾有效防控具有重要意义。在疟疾免疫应答中,在抗肝内期和红内期疟原虫感染中都需要T淋巴细胞来发挥作用。疟原虫的抗原在体内被树突状细胞加工提呈给初始T（native T）细胞以后,其会快速成为效应T细胞,最后大部分的T细胞会发生凋亡而被机体清除,能保存下来的只是很少的一部分,成为免疫记忆T细胞。疟原虫感染中发现存在着免疫抑制现象,由于抑制因素的存在,疟原虫感染后会加速T细胞的终末效应分化进程,抑制T细胞免疫记忆的持久性建立,疟原虫特异性T细胞被抑制而出现明显减少。近年来,程序性细胞死亡受体-1（programmed cell death-1,PD-1）以及其配体（PD-L1）信号通路可能参与到疟疾免疫记忆的建立中。研究表明T细胞耗竭参与多种慢性感染和肿瘤的发生发展。目前的研究显示,在疟疾感染中,PD-1能够介导T细胞出现功能耗竭。近期研究结果还发现,疟原虫感染不仅能诱导T细胞出现功能的耗竭也能引起B细胞的耗竭,由此表明PD-1的存在可能会潜在阻断疟疾感染的有效控制。但亦有研究显示,记忆T细胞数量在PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠间无显著性差异。目前PD-1/PD-L1通路在疟疾初次免疫应答以及免疫记忆的形成和维持中的作用及其发挥作用的机制未见明确的报道。为此,利用伯氏疟原虫Plasmodium berghei ANKA（Pb ANKA）感染BALB/c小鼠为模型,PD-1单抗阻断分析PD-1信号缺失对免疫效应细胞功能的影响,探讨PD-1在疟疾初次免疫应答以及免疫记忆建立中的可能作用,以期为控制疟疾感染研发有效疫苗提供新的理论依据。方法:1、实验动物及疟疾感染模型构建。建立伯氏疟原虫Pb ANKA初次感染模型:使用BALB/c小鼠进行腹腔免疫1×10⁶伯氏疟原虫Pb ANK感染的红细胞,此组为初次正常感染组（infection group）。建立伯氏疟原虫Pb ANKA再次感染模型:选BALB/c小鼠腹腔免疫1×10⁶Pb ANKA感染的红细胞。在感染后第4-5天进行氯喹药物治疗。在痊愈后第30天进行腹腔感染同种疟原虫Pb ANKA,此组为再感染组（reinfection group）。建立初次感染小鼠PD-1单克隆抗体阻断模型:初次感染组小鼠在伯氏疟原虫Pb ANKA初次感染后,分别在第0天、第3天、第5天和第7天进行PD-1单抗阻断（200μg i.p./次/只）,此组为初次感染抗体阻断组（PD-1mAb group）。建立再次感染小鼠PD-1单克隆抗体阻断模型:再感染组小鼠在伯氏疟原虫Pb ANKA再感染后,分别在第0天、第3天、第5天和第7天进行PD-1单抗阻断（200μg i.p./次/只）,此组为再次感染抗体阻断组（PD-1 mAb group）。对照组同时段注射等剂量PD-1单抗同型对照。每组9只小鼠。2、计数红细胞感染率以及生存率。在伯氏疟原虫Pb ANKA感染小鼠的不同时间点,各组小鼠采用尾静脉采血的方式,玻片上制成薄血膜,固定晾干,进行Giemsa染色后,显微镜下计数各组小鼠红细胞感染率,动态监测各感染组小鼠原虫血症水平,每日记录各感染组小鼠死亡情况,计算各感染组小鼠生存率。3、制备脾细胞悬液。各组小鼠感染后第5天,在超净工作台中无菌取出脾脏,研磨法将脾脏制成脾细胞悬液。使用24孔板培养脾细胞,将调好浓度的脾细胞悬液（终浓度为1×10⁷个/ml）加入到24孔培养板（FALCON）中,每孔中加入500μl脾细胞悬液,每个样品设置3个孔。CO₂培养箱培养48小时后,收集脾细胞,350g离心10min,收集脾细胞培养上清,-80℃冰箱保存,用于之后细胞因子的测定。4、血清分离。初次感染组小鼠感染后第5天,再次感染组小鼠感染后第12天,采取眼球采血方式,于1.5ml离心管中留存各组小鼠的全血,室温下静置1-2小时,4℃过夜,血清自然析出,3000转/分,离心10分钟,分离血清至新的离心管中,做好标记,-80℃冰箱保存,用于之后血清抗体的测定。5、荧光抗体染色流式细胞仪分析。制备的脾细胞悬液进行细胞表面染色:设阴性对照管、单染管和实验管,每管中加入洗好的1×10⁶个脾细胞,阴性对照管中加入同种型对照抗体,其余各管中加入20μl相应的荧光标记单克隆抗体（mAb）,震荡混匀后,室温避光孵育15-20分钟。2000g离心5 min洗掉多余的荧光抗体,弃上清后加入0.5 ml PBS待上机检测。胞内染色方法:设阴性对照管、单染管和实验管,每管中加入洗好的1×10⁶个脾细胞,依次加入PMA（浓度为50ng/ml）、Ionomycin（浓度为1μg/ml）和BFA（浓度为10μg/ml）刺激4-6个小时（37℃,5%CO₂的细胞培养箱）,PBS洗3次后阴性对照管中加入同种型对照单克隆抗体,其余各管中加入表面标志的荧光单克隆抗体,4℃避光孵育30 min,PBS洗2次后,加入200μl破膜液4℃避光破膜30 min,破膜洗液洗2次后,实验管中加入胞内染色荧光单克隆抗体,PBS洗2次后。弃上清,加PBS 500μl,待上机检测。使用美国B&D公司流式细胞仪（FACS Celesta）测定检测样本,每个检测的样本首先收集100,000个脾细胞,使用阴性对照管确定电压,用单染管调好补偿,在分析数据时,首先使用前向散射角（FSC）及侧向散射角（SSC）将脾细胞进行分群,将同型对照作为参考,以二维散点图显示,记录百分比。6、细胞因子以及血清特异性抗体检测。用双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA测定）试剂盒检测保存的脾细胞上清中IFN-γ、IL-10、IL-6和TNF-α分泌水平按照使用说明书进行操作,最后检测样本450nm处的OD值,使用全自动酶标仪。利用标准品绘制标准曲线,检测样本中细胞因子的含量（pg/ml）。制备伯氏疟原虫Pb ANKA全虫抗原,表达和纯化裂殖子表面蛋白（merozoite surface protein,MSP）-1 C末端19kD片段(MSP1₁₉)重组蛋白,用于检测抗伯氏疟原虫Pb ANKA全虫抗原抗体和抗重组MSP1₁₉特异性抗体水平,检测样本450nm处的OD值,使用全自动酶标仪。7、脾细胞细胞因子mRNA表达水平检测。Trizol法提取脾细胞总RNA,去除RNA中的基因组DNA（genomic DNA,gDNA）,RNA反转录成互补DNA（complementary DNA,cDNA）,采用实时荧光Real-time PCR技术,检测脾细胞中IL-10、IL-6、IL-21的mRNA表达水平。8、统计分析。数据使用SPSS软件,版本23.0（SPSS Inc,美国）,使用One-way ANOVA检验比较分析各组均值差异,所有数据采用平均值±标准误差（SEM）的方法表示。p<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1、PD-1阻断对伯氏疟原虫Pb ANKA初次感染的影响。伯氏疟原虫Pb ANKA感染的BALB/c小鼠在感染后第6天,外周血中出现疟原虫感染的红细胞,随后红细胞感染率快速升高,在感染后第17天达到40%左右,在感染后第15天小鼠出现死亡,第23天小鼠全部死亡;然而,使用PD-1单克隆抗体之后,小鼠感染率和正常感染小鼠没有明显差异,但PD-1促进小鼠死亡,于感染后第13天开始出现死亡,第18天小鼠全部死亡。在感染后第5天通过流式细胞仪对脾脏经典树突状细胞（conventional dentritic cells,cDCs）和浆样树突状细胞（plasmacytoid DC,pDCs）,DCs上MHCⅡ、CD86以及PD-L1表达情况进行检测。我们发现cDCs和pDC在正常感染出现明显的升高,使用PD-1单抗后,cDCs数量明显下降,pDC没有明显变化,CD11c⁺DC上CD86和MHCⅡ表达水平在单抗阻断组和正常感染组也没有差异。但是cDCs上PD-L1表达水平在单抗阻断之后出现明显升高。在感染后第5天检测PD-1阻断后对小鼠脾细胞中调节性T细胞（regular T cells,Tregs）、骨髓来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）、Th1、活化T、滤泡辅助T细胞（follicular helper cells,Tfh）数量的影响。我们发现在感染后第5天,PD-1阻断对Treg、Tfh和活化T没有明显的影响。MDSCs在单抗阻断组出现明显增加,而Th1出现明显降低。对脾细胞mRNA分析发现,IL-10 mRNA在两组之间没有明显变化,IL-21和IL-6mRNA在单抗阻断组出现明显降低。之后对脾细胞培养上清中细胞因子进行检测发现,PD-1阻断后TNF-α没有明显变化,而IFN-γ、IL-10和IL-6都明显降低。在感染后第12天检测PD-1阻断后对小鼠脾细胞中中央记忆T细胞（central memory T cell,TCM）、效应记忆T细胞（effector memory T cell,TEM）、长寿浆细胞、短寿浆细胞数量、抗全虫抗原IgG、IgG1和IgG2a以及特异性抗体抗MSP-1₁₉抗体的影响。对于免疫记忆,我们发现感染后第12天,PD-1阻断后TCM被明显抑制,而发挥记忆功能的TEM在两组之间没有明显改变。在单抗阻断组短寿浆细胞明显被抑制,而长寿浆细胞没有出现明显变化。同时,血清抗体IgG、IgG1和IgG2a在两组之间均没有差异,特异性抗体抗MSP-1₁₉抗体在两组之间也没有差异。2、PD-1阻断对伯氏疟原虫Pb ANKA再感染的影响。再感染中,正常再感染小鼠,感染率升高很快,在感染后第18天左右感染率达到40%左右,之后小鼠开始出现死亡,而PD-1阻断使小鼠红细胞感染率明显下降,最后痊愈,小鼠全部存活。在伯氏疟原虫Pb ANKA再感染中,通过流式细胞仪对脾脏cDCs和pDCs,DCs上MHCⅡ、CD86以及PD-L1表达情况进行检测。cDCs和pDCs在PD-1阻断后都明显升高,并且DCs表达的CD86和MHCⅡ在单抗阻断组都明显升高,DCs细胞上PD-L1表达在两组之间没有差异。在再感染后第5天,检测PD-1阻断后对小鼠脾细胞中Tregs、MDSCs、Th1、活化T、Tfh数量的影响。PD-1阻断对Treg没有明显的影响。Tfh和活化T在单抗阻断组出现明显增加,对Th1细胞没有显著影响。qRT-PCR对脾细胞细胞因子mRNA进行检测发现,脾细胞IL-21mRNA在单抗阻断组出现增加,但是没有显著差异。ELISA检测脾细胞培养上清中细胞因子发现,在再感染中,PD-1阻断后TNF-α和IL-6都明显升高,而IFN-γ在单抗阻断组没有明显变化,IL-10明显降低。在再感染后第5天检测PD-1阻断后对小鼠脾细胞TCM、TEM、长寿、短寿浆细胞数量、抗全虫抗原Ig G、IgG1和IgG2a以及特异性抗体抗MSP-1抗体的影响。PD-1阻断后TCM在单抗阻断组明显升高,但是TEM没有改变。虽然短寿浆细胞没有明显变化,但是长寿浆细胞在单抗阻断组出现明显升高。而血清抗体抗全虫抗原IgG1和IgG2a在单抗阻断组均出现升高,尤其是特异性抗体抗MSP1₁₉抗体IgG明显升高。PD-1阻断后能明显增强小鼠的免疫记忆功能。结论:1、伯氏疟原虫Pb ANKA感染BALB/c小鼠,在初次感染中,PD-1单抗阻断后固有免疫和获得性免疫受损;2、伯氏疟原虫Pb ANKA感染BALB/c小鼠,PD-1单抗阻断后,在初次感染中,记忆细胞被明显抑制;3、伯氏疟原虫Pb ANKA感染BALB/c小鼠,PD-1单抗阻断有助于再次感染中固有免疫和获得性免疫的增强;4、再次感染中,PD-1抑制作用被阻断后,能够增强伯氏疟原虫Pb ANKA感染BALB/c小鼠的记忆细胞和抗体产生。