背景和目的p140Cap主要表达于大脑、睾丸以及富含上皮的组织如乳腺、肺、肾和大肠。关于p140Cap在人类肿瘤组织中表达的报道还比较少。近期一项乳腺癌的筛查中发现,在伴有淋巴结转移和高度增殖的肿瘤组织中,p140Cap的阴性表达率高达70%,说明p140Cap表达与肿瘤的恶性程度成负相关。另外一项研究结果显示,乳腺癌中Srcinl基因的mRNA表达水平与预后不良因素有一定的相关关系。目前对p140Cap对大肠癌的影响的研究甚少,本实验于基于临床标本,质粒过表达、RNAi干扰细胞株,裸鼠原位移植瘤,从组织水平、细胞水平以及体内水平研究pl40Cap对大肠癌增殖、凋亡、转移侵袭的影响。材料和方法1. p140Cap在癌旁和结肠癌组织中的表达：南方医院胃肠外科手术室收集23对肠癌组织和对应的癌旁组织,应用Western blot法检测p140Cap蛋白表达,GAPDH为内参。2. p140Cap在癌旁和结肠癌组织中的表达：南方医院消化科内镜室收集126对以上同一患者结肠癌组织及癌旁正常组织(>5cm)标本,制作组织切片,应用免疫组化染色(IHC)检测p140Cap表达,判断阳性表达,并收集年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤淋巴结转移、浆膜浸润、组织病理学分型、TNM分期等临床病理资料,Pearson χ2检验。3. p140Cap在结肠癌转移淋巴结组织的表达：南方医院胃肠外科手术室收集25例结肠癌转移淋巴结组织,应用免疫组化染色(IHC)检测p140Cap表达。4. p140Cap在结肠息肉表达：南方医院消化科内镜室收集38例大肠增生性息肉、42例腺瘤性息肉,制作石蜡切片,免疫组织p140Cap的表达,观察p140Cap在细胞表达部位和强度的差异。进行了p140Cap在大肠组织中表达分布差异分析,并与结肠癌阳性表达进行比较。5. p140Cap在肠癌细胞系中的表达：收集南方医院实验室保存的8个LS174T, SW620, SW1116, LoVo, SW480, Caco-2, DLD1和HT29等肠癌细胞株,提取细胞总蛋白,应用Western blot方法检测p140Cap蛋白表达。6.建立p140Cap稳定过表达细胞株(p140Cap-pcDNA3.1, pcDNA3.1为其阴性对照株)：化学合成全基因,酶切pcDNA3.1质粒载体,重组目的质粒p140Cap-pcDNA3.1, PCR验证并测序。lipofectamine2000稳定转染p140Cap-pcDNA3.1质粒到LoVo细胞,G418筛选,Western Blot验证。7.建立瞬时敲低p140Cap表达细胞株(p140Cap-siRNA, siRNA为其阴性对照株)：lipofectamine2000瞬时转染p140Cap-siRNA到LoVo细胞,G418筛选,Western Blot验证。8. p140Cap对结肠癌细胞侵袭转移的影响：划痕实验、侵袭小室实验检测过表达或敲低p140Cap细胞对侵袭转移能力的作用。9.建立稳定敲低p140Cap表达细胞株(p140Cap-shRNA, shRNA为其阴性对照株)：以5MOI、10MOI、20MOI不同滴度的p140Cap-shRNA漫病毒分别感染LoVo细胞,荧光显微镜下观判断察感染效率,Western blot验证。10. p140Cap对细胞增殖影响：WST-1实验和平板细胞克隆形成实验检测稳定过表达或敲低p140Cap细胞对细胞增长速度的作用。11. p140Cap对细胞凋亡影响：流式细胞技术检测敲低p140Cap细胞对细胞凋亡作用,分析凋亡细胞比例。12.建立裸鼠原位移植瘤模型以及评估5-Fu对原位移植瘤生长影响：分别将shRNA, p140Cap-shRNA两组细胞(5×106/0.1mL)皮下接种到5周龄雄性BALB/c-nu/nu裸鼠的右侧背部各10只,2周后原位移植瘤长至长径5mm左右时,予注射有感染p140Cap-siRNA或siRNA细胞的裸鼠腹腔注射5-Fu(20μg/g,每2天1次,共两周)或生理盐水(100μl/只,每2天1次,共3周)各五只。每两天观察生长情况,每周测量肿瘤体积,计算肿瘤生长抑制率,5周后取肿瘤组织HE染色。13. p140Cap与Raf-MEK-ERK信号转导通路：Western blot分别检测p140Cap-shRNA或shRNA两组细胞ERK1/2、phospho-ERK1/2、MEK1、 phospho-MEK1的表达,并进一步检测凋亡相关蛋白Capase3、8、9、Bcl2,以及增殖相关蛋白CyclinD1、p21、p27的表达。14.统计学分析：数据以X±s表示,采用SPSS16.0统计软件,率的比较采用Pearson x2或fisher检验,细胞增殖、凋亡、侵袭转移采用独立实验t检验,裸鼠肿瘤体积的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计学处理,以P<0.05为差异具显著性。结果1. Western blot证实73.9%肠癌组织p140Cap表达高于对应癌旁组织(17/23)。2. p140Cap在癌旁、结肠腺瘤和结肠癌组织以及结肠癌转移淋巴结中的表达：经免疫组化SP法染色的阳性物质为黄色颗粒,主要定位于细胞浆中。结肠癌组织p140Cap阳性表达率(评分大于4分,++/+++)在为85.7%(108/126)；癌旁正常组织p140Cap阳性表达率为12%(6/50),,结肠腺瘤p140Cap阳性率为38.1%(16/42),非肿瘤性息肉p140Cap阳性率为15.8%(6/38),结肠癌转移淋巴结p140Cap阳性率为100%(25/25)。经统计分析,结肠癌组织p140Cap表达阳性表达率高于癌旁组织(P<0.001)。3.结肠癌组织中p140Cap表达与临床病理特征的关系：结肠癌p140Cap阳性表达率与性别、年龄、肿瘤位置无显著性差异(P<0.05)；与肿瘤大小、肿瘤淋巴结转移、浆膜浸润、组织病理学分型及TMN有显著性差异(P<0.05)。4. p140Cap在肠癌细胞系中的表达：8株结直肠癌细胞系中p140Cap蛋白均有高或较高的表达水平,而293T不表达。5.成功构建p140Cap-pcDNA质粒：化学合成的p140Cap基因片段重组到pcDNA3.1质粒,转化到感受态细胞,扩增后提取质粒,琼脂糖凝胶电泳验证分子量符合,基因测序测通成功。6.成功建立p140Cap过表达细胞株：经过Western Blot验证筛选出的第7个单克隆LoVo (Clone7) p140Cap表达最高,命名为p140Cap-PcDNA3.1细胞株,其阴性对照pcDNA3.1质粒转染LoVo命名为pcDNA3.1细胞株,选择p140Cap表达最高的p140Cap-PcDNA3.1株,进行下一步研究。7. siRNA干扰敲低LoVo细胞p140Cap表达：Western Blot检测发现,由3条p140Cap-siRNA瞬转的3株LoVo细胞p140Cap均被敲低,p140Cap-siRNA2感染株p140Cap最低,命名为p140Cap-siRNA株。8. p140Cap促进对结肠癌细胞侵袭转移：划痕实验发现,p140Cap上调的细胞划痕48h后显微镜下观察划痕宽度变窄(P<0.01,三次独立试验)；侵袭小室实验发现,36h后p140Cap上调的细胞穿过小室的细胞增多(P<0.01,三次独立试验),同理p140Cap下调则相反。9.建立稳定敲低p140Cap表达细胞株：利用慢病毒敲低p140Cap, p140Cap-shRNA感染LoVo,48h荧光显微镜下观查20MOI滴度p140Cap-shRNA感染率达到90%以上,Western blot证实p140Cap表达下调,命名为p140Cap-shRNA株。10. p140Cap促进结肠癌细胞增殖：WST-1实验证实p140Cap上调促进细胞生长(第3,5,7天),平板细胞克隆形成实验显示p140Cap上调克隆数量增加P<0.01,三次独立试验)。p140Cap下调则相反。11. p140Cap抑制结肠癌细胞凋亡：流式细胞技术检测显示,p140Cap-shRNA组的细胞凋亡率(Q2+Q3)高于对照组shRNA组(P<0.01,三次重复试验)。12. p140Cap下调抑制裸鼠原位移植瘤生长,增加裸鼠对5-Fu化疗敏感性：接种细胞5周后,20只裸鼠无死亡,均有肿瘤生长,解剖后未发现其它肺、肝组织有转移结节,HE证实原位移植瘤为恶性肿瘤组织,显示敲低组较之对照组肿瘤坏死面积小。接种细胞5周后,测得各组种植瘤体积shRNA+生理盐水组(1485.2±224.7)、shRNA+5-FU组(595.5±117.3)、p140Cap-shRNA组+生理盐水组(581.4±139.7)(mm3)、p140Cap-shRNA+5-FU组(240.6±78.3)(mm3),经统计学分析,p140Cap-shRNA+生理盐水组,p140Cap-shRNA组+生理盐水组、p140Cap-shRNA+5-FU组三组肿瘤体积与shRNA+生理盐水组比差异有显著性(P<0.05, One-Way ANOVA)。13. p140Cap参与Raf-MEK-ERK信号转导通路影响结肠癌细胞增殖和凋亡：p140Cap-shRNA组phospho-ERK1/2、phospho-MEK1的表达shRNA组细胞ERK1/2,MEK1的表达。p140Cap-shRNA组shRNA组细胞较的活性Capase3、8、9,p21、p27表达增高,Bcl2, CyclinD1表达降低。结论1.p140Cap在大肠癌组织高表达,并且与某些预后相关的大肠癌临床病理分型存在显著差异,可能影响大肠癌不良预后。2. p140Cap在大部分大肠癌细胞浆高表达,少部分大肠腺瘤表达,正常组织极少表达,可能在大肠癌发展的过程中发挥促癌作用。3. p140Cap在结肠癌细胞高表达,p140Cap促进肠癌细胞生长、转移和侵袭,抑制凋亡。4. p140Cap下调表达抑制裸鼠原位移植瘤的生长,增加裸鼠对5-Fu药物敏感性。5. p140Cap参与Raf-MEK-ERK信号转导通路,从而影响细胞增殖与凋亡。6. p140Cap在在大肠癌的发生发展中表现为癌基因的特性,为预测大肠癌预后的一个新的分子标志物。