成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor2，FGF2)，也称作碱性成纤维生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)，是一种多功能的多肽细胞生长因子，可以调节细胞增殖、分化、粘附、迁移和凋亡。FGF2可产生多种分子量的FGF2亚型，包括18kDa的低分子量亚型(lo-FGF2)和22，23，24，34kDa等高分子量亚型(hi-FGF2)。hi-FGF2在线粒体参与情况下，通过激活ERK1/2信号通路介导染色质聚集和细胞凋亡。细胞凋亡从启动、执行、调控阶段是由蛋白质之间相互作用的结果。这种作用受蛋白质的表达水平、亚细胞定位及各种翻译后修饰的影响。研究表明，能与hi-FGF2产生相互作用的蛋白主要有热休克蛋白70(heat shock protein，HSP70)，p68 RNA解旋酶（p68 RNA helicase，p68)和核不均一核糖核蛋白(Heterogeneous ribonucleoprotein，hnRNPs)，而与hnRNP相互作用的蛋白又有 p68和补体成分1 Q亚补体结合蛋白（Complement component1Q subcomponent-binding protein，C1QBP)。并且有研究指出，与hnRNP相互作用的蛋白都是潜在的能与hi-FGF2相互作用的蛋白，应作为进一步的研究对象。而p68已证实和hi-FGF2相互作用，C1QBP引起了我们的关注。C1QBP，也称作透明质酸结合蛋白1（Hyaluronic acid binding protein1，HABP1)，在线粒体驱动的细胞凋亡过程中起着重要的作用。C1QBP能否与hi FGF2相互作用，以及是否在hi-FGF2介导的细胞凋亡发挥关键作用未有研究报道。本研究通过在HEK293细胞中瞬时转染hi-FGF2，建立hi-FGF2高表达模型，利用流式细胞检测技术、RT-PCR、Western blot以及免疫共沉淀等方法，探讨高表达hi-FGF2介导细胞凋亡的作用和机制。　　目的：　　探讨过表达hi-FGF2介导细胞凋亡的作用及其机制。　　方法：　　1. hi-FGF2-pDsRed1-N1重组质粒进行转化、扩增、提纯等步骤，得到高纯度质粒DNA备用，并送至华大基因公司测序鉴定。　　2.在HEK293细胞中过表达hi-FGF2：采用瞬时转染法，荧光倒置显微镜观察hi-FGF2的转染效率。　　3.将培养的HEK293细胞随机分组：CON组、pDsRed组、hi-FGF2组，检测过表达hi-FGF2的HEK293细胞中细胞凋亡情况：JC-1染色，流式细胞仪(FCM)检测线粒体膜电位；Western-blot法检测细胞色素C(Cyto C)在线粒体中和胞浆中的蛋白水平。　　4. Western-blot法检测HEK293细胞中hi-FGF2过表达后的C1QBP的蛋白水平。　　5. RT-PCR法检测HEK293细胞中hi-FGF2过表达后的C1QBP的mRNA表达水平。　　6.将培养的HEK293细胞随机分组：分为正常对照组(INPUT)三组，分别为：CON组、pDsRed组、hi-FGF2组；阴性对照组(IgG)三组，分别为：CON组、pDsRed组、hi-FGF2组；免疫沉淀（IP）组三组，分别为：CON组、pDsRed组、hi-FGF2组，免疫共沉淀法检测过表达的hi-FGF2与C1QBP的相互作用。　　7.在HEK29细胞中，采用瞬时转染法转染C1QBP RNAi，荧光倒置显微镜观察si-C1QBP的转染效率，PCR和Western-blot法检测C1QBP RNAi干扰效率。　　8.纯化线粒体蛋白，检测过表达的hi-FGF2在线粒体中的表达及干扰C1QBP后hi-FGF2在线粒体中的变化。　　9.将培养的HEK293细胞随机分组：CON组、pDsRed组、NC组、si-C1QBP组、hi-FGF2、si-C1QBP+hi-FGF2共转染组，检测干扰C1QBP后，过表达hi-FGF2的细胞凋亡情况的变化： JC-1染色，流式细胞仪(FCM)检测线粒体膜电位；Western-blot法检测Cyto C在线粒体中和胞浆中的蛋白水平。　　结果：　　1.质粒hi-FGF2-pDsRed1-N1经华大基因测序，采用NCBI BLAST软件进行比对，测序结果与目的基因序列完全一致，插入方向和读码框架正确，重组质粒正确。　　2.成功转染hi-FGF2-pDsRed1-N1到HEK293细胞中，在荧光倒置显微镜下可观测到红色荧光，并提示过表达hi-FGF2主要定位在细胞核，转染效率达到80％以上。线粒体膜电位检测结果表明，hi-FGF2组凋亡率为(54.10±3.94)%，与CON组(3.95±0.64)%和pDsRed组(9.41±0.31)%相比，凋亡率显著性升高(P<0.01)；Western blot检测Cyto C表达结果显示，在线粒体中，hi-FGF2组(0.61±0.06) Cyto C表达比CON组、pDsRed组(1.23±0.12)显著减少(P<0.05)，并且有Cyto C释放到胞浆。　　3.过表达hi-FGF2的HEK293细胞中，hi-FGF2组(2.23±0.05)，与CON组、pDsRed组(1.13±0.01)相比，C1QBP蛋白表达显著升高(P<0.01)；hi-FGF2组(2.16±0.03)与CON组、pDsRed组(0.85±0.01)，hi-FGF2组C1QBP mRNA表达显著升高(P<0.01)。　　4. Western blot结果显示，用FGF2抗体可以将C1QBP从细胞裂解液中沉淀下来，同时用C1QBP抗体可以将hi-FGF2蛋白从细胞裂解液中沉淀下来，而用抗鼠/兔IgG抗体免疫沉淀的阴性对照组中未检测到RFP和C1QBP，说明过表达hi-FGF2与C1QBP在细胞内存在特异性的相互作用。　　5.倒置荧光显微镜下观察C1QBP转染效率，NC阴性对照有Cy3红色荧光标签，可以观察到转染效率达到80%；RT-PCR检测C1QBP干扰效率，以CON mRNA表达量为1，NC、C1QBP1/1:2、 C1QBP1/1:4、C1QBP1/1:6、C1QBP2/1:2、C1QBP2/1:4、C1QBP2/1:6、C1QBP3/1:2、C1QBP3/1:4、C1QBP3/1:6分别为(1.05±0.01)、(0.61±0.01)、(0.43±0.00)、(0.29±0.00)、(0.55±0.01)、(0.35±0.01)、(0.20±0.00)、(0.63±0.01)、(0.63±0.01)、(0.69±0.01)，si-RNA中以si-RNAⅡ，在lip2000:siRNA=1:6时干扰效率最高，达到80%。Western-blot检测进一步验证干扰效率，以CON光密度为1，NC、si-C1QBP的光密度分别为(1.17±0.02)、(0.18±0.01)。　　6.以RFP为检测抗体，线粒体中，si-C1QBP+hi-FGF2组(0.33±0.02)比hi-FGF2组表达显著的降低(P<0.01)，干扰C1QBP能明显抑制hi-FGF2在线粒体中的表达。　　7.线粒体膜电位检测结果表明，各组凋亡率分别为CON组(3.95±0.64)%、pDsRed组(9.41±0.31)%、NC组(5.38±0.38)%、hi-FGF2组(54.10±3.94)%、si-C1QBP组(11.21±0.21)%，si-C1QBP+hi-FGF2组(19.30±1.78)%凋亡率与hi-FGF2组(54.10±3.94)%比较，显著降低(P<0.01)；而 Western blot检测 Cyto C表达结果显示，表达si-C1QBP+hi-FGF2组(0.73±0.14)和hi-FGF2组(0.61±0.06)与CON组相比，显著减少(P<0.05)，胞浆中Cyto C的表达si-C1QBP(0.74±0.17)与hi-FGF2相比，显著减少(P<0.05)。　　结论：　　hi-FGF2在HEK293细胞中过表达后导致细胞凋亡，其作用机制可能hi-FGF2上调C1QBP的表达，hi-FGF2移位到线粒体中与C1QBP相互作用协调诱导细胞凋亡。