HMGB1调控MDSCs分化参与乳腺癌发生的机制研究

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目的:1.通过对乳腺癌中HMGB1表达量、MDSCs比例的检测,分析两者在乳腺癌中的关系。2.通过检测HMGB1、MDSCs之间的关系,研究HMGB1对MDSCs分化的影响及其潜在的分子机制。方法:1.分别从正常鼠、荷瘤鼠中分离出外周血、脾脏和肿瘤,流式细胞仪检测外周血、脾脏中MDSCs的比例,q RT-PCR和Western blotting法测定荷瘤鼠肿瘤中HMGB1、i NOS及ARG1的表达水平。2.分离正常小鼠的骨髓、脾脏,分为对照组、HMGB1组、GM-CSF+IL-6组、GM-CSF+IL-6+HMGB1组和GM-CSF+IL-6+HMGB1+ethyl pyruvate(EP)组进行体外刺激48h后,流式细胞仪检测MDSCs、DCs和巨噬细胞的比例。3.Western blot法检测0min、15min、30 min、60 min、90 min和120 min六个时间点细胞中ERK1/2、STAT3、NF-κB和P38 MAPK蛋白磷酸化水平的改变,骨髓细胞用PDTC、Niclosamide、SB203580、U0126预处理1h后,再加入HMGB1重组蛋白刺激,流式细胞仪检测MDSCs的比例。4.乳腺癌荷瘤鼠建模成功后,随机分为两组,一组给予EP治疗,另一组给予PBS治疗,3天一次,分别于25d和40d处死荷瘤鼠,流式细胞仪检测脾脏、肿瘤中MDSCs的比例。5.从健康的BALB/c小鼠股骨中取出骨髓,用MDSCs免疫磁珠体外分选出G-MDSCs和M-MDSCs,体外用重组HMGB1刺激48h后,流式细胞仪检测各组细胞中MDSCs、DCs和巨噬细胞的比例。结果:1.流式细胞仪检测结果显示荷瘤鼠外周血、脾脏中MDSCs的比例显著高于正常鼠,q RT-PCR检测发现肿瘤组织中HMGB1、i NOS和ARG1的表达量都显著高于癌旁组织,差异有统计学意义。2.经过48h刺激后,流式细胞仪检测结果发现HMGB1组、GM-CSF+IL-6组、GM-CSF+IL-6+HMGB1组相比于对照组,MDSCs比例增加,DCs和巨噬细胞的比例减少,差异有统计学意义;GM-CSF+IL-6+HMGB1+EP组相比于GM-CSF+IL-6+HMGB1组,MDSCs比例减少,DCs和巨噬细胞的比例增加。3.细胞给予250ng/m L HMGB1刺激后,0至120min内,细胞内p-ERK1/2、p-NF-κB、p-P38水平随着时间推移逐渐增高,而p-STAT3却没有这种趋势;给予U0126、SB203580和PDTC作用后,MDSCs比例下降且有统计学意义,而Niclosamide作用后MDSCs比例虽下调但并无统计学意义。4.荷瘤鼠给予EP治疗后,EP组相比于PBS组,肿瘤的体积、重量、脾脏和肿瘤中MDSCs比例均减少且差异有统计学意义。5.MDSCs免疫磁珠体外分选出G-MDSCs和M-MDSCs,体外用HMGB1重组蛋白刺激48h后,流式细胞仪检测发现HMGB1刺激组相对于G-MDSCs和M-MDSCs对照组,MDSCs比例均增加,DCs和巨噬细胞的比例均减少,但无统计学差异。结论:1.在乳腺癌中HMGB1表达上调,MDSCs比例增加,且两者呈正相关关系。2.HMGB1通过NF-κB,ERK1/2和P38 MAPK信号通路调控MDSCs分化,且抑制HMGB1能减少MDSCs的募集,减缓肿瘤生长。
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