论文部分内容阅读
目的：探讨同源盒基因Nkx6.2在因甲状腺素缺乏导致脑发育迟滞过程中的分子作用机制,获得能穿过血脑屏障的并跨膜进入细胞核的TN-Nkx6.2重组蛋白。本文旨在观察同源盒基因Nkx6.2对神经干细胞生长分化的影响。为进一步深入探讨同源盒基因Nkx6.2在甲状腺减低模型的作用机制奠定了物质基础。方法：本实验利用基因克隆技术,将TAT-NLS-Nkx6.2基因片段和空质粒pET-28a分别进行双酶切后,利用T4连接酶连接,将TAT-NLS-Nkx6.2及Nkx6.2基因克隆入pET-28a表达载体中,构建重组质粒pET-28a-TN-Nkx6.2及pET-28a-Nkx6.2,并将重组质粒pET-28a-TN-Nkx6.2及pET-28a-Nkx6.2转化入克隆菌E.coli DH5a中,再转化至E.coli BL21(DE3)中表达,经酶切及测序鉴定重组子,将酶切和测序正确的重组质粒保存于10%的甘油中,平板划线,挑取单菌落于抗Kan的LB培养基中过夜培养,按1：50接种于抗Kan的LB液体培养基,当OD值为0.6左右时,用IPTG诱导目的蛋白表达,并对诱导条件如诱导时间,诱导温度,IPTG浓度进行优化,SDS-PAGE及Western Blot鉴定融合蛋白,pET-28a载体带有融合标签His·Tag,融合标签用于检测和纯化目的蛋白,经组氨酸Ni2+亲和层析纯化融合蛋白。将融合蛋白TN-Nkx6.2, Nkx6.2分别以不同浓度与神经干细胞孵育,免疫荧光细胞化学检测分化后的细胞类型,抗体分别为NF-200、GFAP、 Gal-C。结果：经酶切和测序证实成功构建了重组质粒pET-28a-TN-Nkx6.2及pET-28a-Nkx6.2,按1：50的接种量接入摇瓶,37℃,250r/min培养约4h,当菌液的OD值为0.6时,增添终浓度为lmmol/L的诱导剂IPTG在25℃诱导8h后,融合蛋白的产量最高,能够在E.coli BL21(DE3)中高效表达融合蛋白TN-Nkx6.2,经SDS-PAGE电泳分析,结果显示目的蛋白的表达带的分子量与预期相符,经组氨酸Ni2+亲和层析纯化,得到高纯度的融合蛋白,经Western Blot鉴定,纯化后的融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性,融合蛋白为TN-Nkx6.2和Nkx6.2,融合蛋白TN-Nkx6.2能穿过细胞膜进入神经干细胞影响神经干细胞的分化,经荧光显微镜观察Gal-C的阳性细胞超过75%,有助于向少突胶质细胞方向发展,尤其以增加200μg/L、500μg/L融合蛋白TN-Nkx6.2的实验组最为明显,影响神经干细胞的发育和分化。结论：成功构建的重组质粒pET-28a-TN-Nkx6.2能够在E.coli BL21(DE3)中高效表达融合蛋白TN-Nkx6.2,并能穿过细胞膜进入神经干细胞,融合蛋白TN-Nkx6.2作为一种内源性蛋白,对神经干细胞的定向分化有一定的影响,作为一种信号使分化后的神经干细胞向少突胶质细胞方向发展。