OX40/OX40L是TNFR/TNF家族主要成员,也是免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子,他们的相互作用能够促进T细胞的活化、增殖、迁移、并延长其寿命,促进记忆性T细胞的生成,以及刺激生发中心(GC)的形成和树突状细胞(DCs)的分化成熟。OX40/OX40L还能够促进抗原特异性T细胞的增殖与活化。鉴此,OX40/OX40L途径在自身免疫性疾病、肿瘤以及移植排斥反应中发挥极其重要的作用,成为免疫学研究的热点课题。同时,OX40/OX40L也成为免疫干预的靶分子。本课题研发了一株具有自主知识产权的鼠抗人OX40功能性单克隆抗体,并对其生物学特性展开了初步研究。一、一株新型鼠抗人OX40单克隆抗体的研制【目的】鼠抗人OX40分子单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定。【方法】以高表达人OX40分子的基因转染细胞L929-OX40作为免疫原,常规免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞杂交瘤融合技术,将免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,并以L929-OX40细胞作为阳性筛选细胞,以转空质粒的L929-Mock细胞作为阴性筛选细胞,采用间接免疫荧光技术对杂交瘤进行反复筛选以及多次克隆化培养,获得持续、稳定、高效分泌特异性鼠抗人OX40分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用快速定性试纸法检测抗体Ig亚型;利用间接免疫荧光技术和Western-blot检测抗体特异性;采用细胞核染色体技术对获得的杂交瘤进行核型分析;采用竞争抑制实验分析抗体的抗原结合表位;间接免疫荧光技术分析所获得单抗对于不同来源人肿瘤细胞株表面OX40蛋白的识别作用。【结果】成功获得一株稳定、高效分泌鼠抗人OX40分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为9H8。杂交瘤细胞核型分析结果显示,杂交瘤细胞株的染色体数目在80条以上,超过小鼠B细胞和SP2/0细胞的染色体数,表明其为融合细胞;快速定性试纸法检测结果显示,单抗9H8的重链为IgG1型,轻链则为к链;Western-blot以及间接免疫荧光分析结果显示,单抗9H8能够特异性识别OX40分子,结果与商品化抗体ACT-35相一致;抗体竞争抑制实验结果表明,单抗9H8与本科室业已获得的单抗1F7以及商品化单抗ACT-35识别不同的抗原表位;流式细胞仪检测结果显示,单抗9H8能够识别经激发型CD3单抗活化的人T细胞上OX40分子的表达,并且能够识别脑胶质瘤细胞株SHG-44, SF-295,人乳腺癌细胞株MCF-7,人肺癌细胞株H460,人宫颈癌细胞株HELA, SIHA,人肠癌细胞株CW-2, LS-174T,人视网膜神经母细胞株Y79以及人白血病细胞株U937, U266, Jurkat表面的OX40分子表达。【结论】成功获得1株持续、稳定分泌鼠抗人OX40分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株,该单抗与已经获得的OX40分子单抗识别完全不同的抗原表位,为进一步研究OX40分子ELISA快速检测试剂盒奠定了良好的基础。单抗的研制成功也为进一步研究OX40/OX40L信号通路提供了有力工具。二、鼠抗人OX40单克隆抗体对T细胞的体外协同刺激作用【目的】利用所获得的鼠抗人OX40单克隆抗体,研究OX40信号激发人T细胞的体外活化和增殖等方面的作用。【方法】激发型CD3单抗包被96孔细胞培养板,体外培养人T细胞,并且加入不同浓度的鼠抗人OX40单抗,MTT法检测单抗对T细胞增殖的促进作用,并收集培养上清,ELISA法检测细胞因子的分泌水平;免疫荧光技术分别检测CD4+ T细胞和CD8+ T细胞表面CD25表达。【结果】结果显示,无需CD28信号的协同刺激,所获得的OX40单抗就能够有效地促进T细胞体外大量增殖,并且促进其细胞因子的分泌( IFN-γ,IL-10, TGF-β),上调CD4+ T细胞和CD8+ T细胞表面CD25的表达。由此表明,研制的抗人OX40单抗是一株具有激发作用的功能性抗体。【结论】成功研制一株鼠抗人OX40激发型单克隆抗体,能够在体外促进经CD3活化T细胞的有效增殖,以及细胞因子的分泌;同时对于促进CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的活化、维持其活化时间以及长期存活都具有明显的协同刺激作用。这为体外大量扩增效应性T细胞提供了有效的手段,具有潜在的临床应用价值。