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源自大肠杆菌的RNase P是促使ptRNA 5’端成熟的天然核酶。其催化核心RNA亚单位(M1 RNA)能在缺乏辅助单位C5蛋白情况下,发挥切割作用。RNaseP是结构识别酶,能与mRNA形成RNase P识别的底物形式的小片段RNA称为外部引导序列EGS(Extemal guide sequence)。EGS共价连接到M1RNA的3’末端成为附属于M1RNA的一段引导序列,称为GS。附带GS的M1RNA成为具备自我引导和序列特异切割能力的核酶-M1GS。 人巨细胞病毒DNA聚合酶催化亚单位—UL54,是人巨细胞病毒(HCMV)复制的关键酶。许多HCMV耐药株与该基因点突变相关。因此干扰UL54基因,能抑制HCMV的繁殖以及提高给药治疗效果。 本实验根据陈浩军硕士的体外切割实验,选用具有切割作用的两个核酶T4-M1GS和T7-M1GS构建在携带U6启动子的逆转录病毒载体上,使其在Hela细胞内具备转录能力,研究其对构建在真核载体pZGFP-N1的UL54片段表达的RNA的切割作用,为进一步研究以RNase P为基础的反义RNA技术抑制病毒基因表达奠定基础。 本论文进行了下列实验: T4-M1GS和T7-M1GS分别构建于携带U6启动子的逆转录病毒载体pLXSN上,命名为T4-M1GS-pLXSN和T7-M1GS-pLXSN。 T4-M1GS-pLXSN和T7-M1GS-pLXSN分别与空载体pEGFP-N1共转染Hela细胞,结果显示这两个核酶对报告基因GFP不产生干扰作用。 核酶重组质粒T4-M1GS-pLXSN和底物重组质粒UL54-C-GFP共转染Hela细胞,实验表明核酶T4-M1GS能作用于UL54-C-GFP的RNA片段。进一步将UL54-CD-GFP转染至T4-M1GS-pLXSN稳定表达的Hela细胞中,Northern blot结果表明在Hela细胞中稳定表达的T4-M1GS能切割绝大部分底物UL54-CD。 具有最高体外切割活性的T7-M1GS-pLXSN和底物UL54-CD-GFP共转染Hela细胞,Northern blot结果显示此核酶在细胞水平上仍具有对底物很高的切割作用。 研究结果表明,体外实验筛选到的高切割活性的核酶在细胞内也具有较强的