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第一章慢病毒介导RNA干扰对体外培养大鼠胶质瘤细胞IL-33基因的沉默效应目的构建IL-33基因RNA干扰慢病毒载体并转染体外培养的大鼠胶质瘤细胞,观察其沉默效应。方法1.针对大鼠IL-33基因特异性序列,设计3条IL-33-si RNA序列及1条阴性对照序列,合成包含各正义靶序列的互补DNA链,退火形成双链DNA,插入到经HpaⅠ和XhoⅠ剪切的GV118的慢病毒载体种,PCR筛选阳性克隆,DNA测序鉴定。与慢病毒包装质粒p Helper1.0、p Helper2.0转染至293T细胞,滴度测定后-80℃冰箱保存备用。2.慢病毒重组体转染体外培养的胶质瘤细胞C6,观察转染效率。3.倒置荧光显微镜下观察C6细胞的形态改变,Real-Time PCR检测慢病毒重组体对C6细胞IL-33m RNA的干扰效率。结果1.测序结果证实合成的寡核苷酸链插入正确,重组载体构建成功,测定慢病毒滴度为LV-IL33-RNAi(1)为1×109TU/ml;LV-IL33-RNAi(2)为8×108TU/ml;LV-IL33-RNAi(3)为1×109TU/ml。2.慢病毒重组体能成功转染至C6细胞,相对于阴性对照组,LVIL-33-RNAi(1),LV-IL-33-RNAi(2),LV-IL-33-RNAi(3)组转染至C6细胞后,IL-33m RNA表达水明降低,其中LV-IL33-RNAi(2)组敲减率最高达到了66.5%,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了大鼠IL-33基因的RNA干扰慢病毒载体,其可使胶质瘤细胞C6的IL-33基因表达下调。这样为我们下一步动物体内实验奠定了基础。也为神经系统IL-33基因功能研究提供一种有效工具。第二章脊髓IL-33对佐剂性关节炎大鼠外周炎症及痛觉过敏的调控目的炎症组织的伤害性刺激会增加脊髓背角神经元的兴奋性即发生中枢敏化。神经元兴奋后产生的信号可返回调控外周炎症,具体机制尚未明确。最近一些研究表明,脊髓IL-33参与了中枢敏化介导疼痛反应。我们的目的是研究脊髓IL-33是否也参与了大鼠佐剂性关节炎的外周炎症反应及相关痛觉过敏。方法1.构建大鼠佐剂性关节炎模型,左侧足底皮下注射弗式完全佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)100μl,CFA注射后2天,鞘内注射LV-sh RNA-IL-33和阴性对照病毒。于术前1天和术后6h、12h、24h(1天)、2天、3天、4天、7天、10天、14天、21天观察大鼠行为学变化,记录机械痛阈和热痛阈,测量足趾肿胀度。2.使用Western-blot技术评估CFA组大鼠1天、2天、3天、4天、7天、10天、14天、21天脊髓IL-33蛋白的表达改变,检测CFA+LVIL-33-RNAi组和CFA+LV-IL-33-NC组第14天、第21天脊髓IL-33蛋白表达的改变。取21天各组大鼠左侧踝关节,HE染色观察大鼠关节病理改变。结果1.相比sham组,CFA大鼠的机械痛阈和热痛阈明显下降(P<0.01),而足趾肿胀程度明显增加(P<0.01)。2.外周炎症上调了脊髓IL-33蛋白的表达,LV-IL-33-RNAi组第14天和第21天,脊髓IL-33蛋白水平下调,而LV-IL-33-NC组无下调变化。结论外周炎症上调了脊髓IL-33蛋白的表达,鞘内注射LV-sh RNA-IL-33能下调IL-33蛋白的表达。因此,抑制脊髓IL-33的表达对外周炎症性疾病可能是一种潜在的治疗方法。