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背景与目的:
泛素一蛋白酶体系统(UPS)介导了细胞内多种蛋白的降解，从而参与细胞生命过程的调节。由于该系统的发现及其重要性，以色列及美国的三位科学家共同分享了2004年度诺贝尔化学奖。蛋白酶体本身已经成为抗肿瘤药物、组织缺血一再灌注损伤、免疫调节、糖尿病治疗的重要靶点。经美国FDA批准蛋白酶体抑制剂PS-341已经进入Ⅱ期临床应用于肿瘤的治疗，并取得了比较理想的治疗效果。寻找蛋白酶体抑制剂对于开发我国中医药资源具有重要的应用前景，2006年6月在美的中国学者首次报道了雷公藤成分Celastrol是一个蛋白酶体抑制剂，引起了学术界的广泛重视。本研究旨在建立蛋白酶体抑制剂的筛选平台，并利用此平台对中化药物和生物毒素进行筛选，希望能筛选出一些蛋白酶体抑制剂，为多种疾病治疗提供新的药物治疗手段，同时也为UPS的功能研究提供帮助。
方法与结果:
1．进入筛选药物的入选条件
目前报道的蛋白酶体抑制剂归结起来有以下几个特征：多数具有芳香酮体结构；具有抗肿瘤作用，特别是对血液系统肿瘤的作用明显；具有诱导细胞凋亡的作用；导致泛素-蛋白酶体系统底物蛋白质细胞内积聚并致细胞稳态失衡。
2．蛋白酶体抑制剂初筛平台的建立
在蛋白酶体中主要包括三种蛋白酶，分别为Chymotrypsin-like，Caspase-like，Trypsin-like蛋白酶，目前发现的蛋白酶体抑制剂多数仅作用于Chymotrypsin-like酶，三种蛋白酶的荧光底物分别为Suc-LLVY-aminomethycoumarin(AMC)、Z-LLE-betanaphthylamide(NA)及BZVGR-AMC。
2．1 中药对3T3细胞裂解液中蛋白酶体Chymotrypsin-1ike酶活性的作用根据进入筛选药物的条件，初步选出52个中药进行实验，实验中采用培养的NIH3T3细胞的裂解物作为蛋白酶体供体，细胞裂解物(10μg蛋白)与不同剂量药物作用一定时间后，加入Chymotrypsin-like酶的荧光底物Suc-LLVY-aminomethycoumarin(AMC)，充分反应后，用无水乙醇终止反应，采用荧光分光光度计测定底物发出的荧光强度，以示蛋白酶体酶活性的变化。
通过上面初步筛查，发现EPI-001、紫草素、姜黄素、黄岑素、大黄酸、淫羊藿苷组随着药物浓度升高，其底物发出的荧光强度明显下降；滨蒿内酯、葛根素组则明显上升，其中已有学者报道姜黄素是一个蛋白酶体抑制剂。由于某些药物能够自身淬灭荧光和自发荧光，为了明确检测到的荧光强度的下降或上升究竟是药物对蛋白酶体的抑制或激活作用还是药物自身淬灭荧光或自发荧光的作用，接着对这几种药物进行了药物自身淬灭荧光和自发荧光对照实验。
2．2药物自身对淬灭荧光和自发荧光的作用
2.2.1 药物自身淬灭荧光对照实验：实验中采用3T3细胞裂解液作为蛋白酶体供体，先加入Chymotrypsin-like酶荧光底物Suc-LLVY-aminomethycoumarin(AMC)，充分反应后，无水乙醇终止反应，然后再加入不同剂量的中药，一段时间后，检测荧光强度的变化。
结果发现EPI-001和紫草素组底物发出的荧光无明显变化，排除了药物自身淬灭荧光的作用；而黄岑素、大黄酸、淫羊藿苷组则随着浓度的升高，其荧光强度明显下降，说明这三个药物具有淬灭荧光的作用。
2.2.2 药物自发荧光对照实验：实验中也是采用3T3细胞裂解液作为蛋白酶体供体，但是不加入荧光底物，直接加入不同剂量的药物，一段时间后，检测荧光强度的变化。
结果发现随着滨蒿内酯、葛根素组药物浓度的升高其荧光强度也明显升高，说明这两个药物能够自发荧光，排除了能够活化蛋白酶体的作用。
2.3 药物对3T3细胞裂解液中蛋白酶体Caspase-like、Trypsin-like酶的作用通过上面的实验，初步认为紫草素和EPI-001能够抑制蛋白酶体Chymotrypsin-like酶活性，随后进行了这两个药物对Caspase-like、Trypsin-like酶活性影响的实验，结果显示紫草素和EPI-001对Caspase-like、Trypsin-like酶无明显抑制作用。
2.4 药物对纯化20S蛋白酶体的作用为了排除其他一些物质的干扰，选用纯化的20S蛋白酶体代替3T3细胞裂解液作为蛋白酶体供体，实验结果与采用NIH3T3蛋白裂解物试验一致。
2.5 药物对活细胞蛋白酶体的作用以上皆是在体外检测药物对蛋白酶体酶活性的影响，为进一步确证并排除体外化学物质的假象作用，最后在活细胞层面检测EPI-001对细胞内蛋白酶体酶活性的作用。培养的3T3细胞直接接种在24孔培养板，经过不同浓度的药物作用不同的时间后，在培养液中直接加入蛋白酶体荧光底物，作用2小时后取培养上清测定荧光强度以表示酶解活性。
实验结果显示紫草素和EPI-001对蛋白酶体的抑制呈现剂量和时间依赖的关系。
结论:
1．建立了快速、可靠及稳定的蛋白酶体抑制剂和活化剂的初筛平台。
2．初步筛选出了EPI-001和紫草素这两种药物具有蛋白酶体抑制的作用。