缩二脲是肥料中的一种对作物有毒害的物质,已被大家所公认。缩二脲的产生是由于尿素生产过程中或作为生产复混肥料氮源的尿素在造粒过程中温度过高缩合而成。肥料中过高的缩二脲含量使小麦、玉米等肥害事件屡次发生,经济损失严重。尿素质量的国家标准(GB 2440—91)对缩二脲含量有硬性要求,尿素中缩二脲含量大于1.5%时为不合格产品,但复混肥质量标准中还没有制定相关的限制性定量指标。目前缩二脲对作物造成的毒害作用还没有比较好的解决方法,传统的补救措施是采用灌水排毒或耕耙分散毒素,使缩二脲浓度降低,补种或改种其它作物,最后补施一些优质氮磷钾肥料。采用生物修复将缩二脲降解成无毒害作用的含氮化合物是一种有效的手段。土壤脲酶不能水解缩二脲,所以缩二脲在土壤中的降解速度很慢,好氧条件下5-8周内只有15-21%的外加缩二脲能被转化。但有关文献表明反刍动物瘤胃培养条件下存在着脲酶以外的降解缩二脲反应。本研究期望：1.找到复混肥中缩二脲对作物毒害作用的临界值,为制定复混肥国家标准提供数量化的科学依据。2.采用一种简便的检测方法从土壤中筛选出能够高效降解缩二脲的菌株。3.对获得的高效降解缩二脲菌株进行绿色荧光蛋白标记,跟踪其在土壤中的定殖行为。通过水培和盆栽试验方法对冬小麦、玉米、番茄、油菜、水稻五种供试作物耐缩二脲毒害作用的临界值进行测定,在适宜的施肥条件下,水培试验表明：1L水溶液中缩二脲含量大于35mg、40mg、20mg、15mg、15mg时,会对相应作物生长造成显著毒害。盆栽试验显示：复混肥中缩二脲含量对相应作物生长造成显著毒害作用的临界值为1.6%、2.0%、2.0%、2.0%、2.0%。考虑到氯离子等影响因素的存在,建议复混肥中缩二脲含量应控制在1%以下。采用以缩二脲作为唯一氮源筛选出耐高浓度缩二脲的菌株,通过比对耐缩二脲菌株在添加和不添加缩二脲作为底物的无氮培养基中的生长状态初步确定是否利用缩二脲,最后结合发酵液中氨态氮的蒸馏滴定法以及发酵液中缩二脲含量的高效液相色谱定量分析法从新疆农大试验田、河南焦作肥料厂、南京农业大学校园内的供试土壤以及本实验室保存的菌株中筛选到一株高效缩二脲降解菌,通过对菌株进行生理生化和16S rDNA序列分析,初步鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiella),编号为GW-1. GW-1菌株在LB培养基、无氮培养基和以缩二脲为唯一氮源的无氮培养基上均可正常生长,在含缩二脲的无氮培养基上生长时7h进入对数生长期,其最适生长温度为28℃,最适pH为7.10,大接种量和溶氧量能促进GW-1菌株的生长,好氧条件下在缩二脲含量为500mg/L的无氮培养基中培养20h后,GW-1培养上清液中缩二脲降解率达76.98%,34h时降解率达100%,GW-1菌株具有很强的缩二脲降解能力。通过三亲结合对GW-1菌株成功进行了gfp基因标记,标记菌株编号为GW-1-GFP,通过对野生型菌株和标记菌株的形态学特征、质粒图谱、荧光检测和降解缩二脲能力的比较,发现GW-1菌株已获得gfp标记的质粒,且标记菌株GW-1-GFP降解缩二脲的能力与野生型菌株无明显差别。GW-1-GFP菌株在发挥降解缩二脲功能的同时能够在土壤中作物根际很好地定殖,随着时间的推移,第45天时GW-1-GFP菌株在土壤中未被检测到。未发现GW-1-GFP菌株对土壤中原有微生物的生长产生影响。发酵有机肥对GW-1-GFP菌株在土壤中的定殖有一定的促进作用,且明显提高了土著微生物中芽孢杆菌数量。GW-1-GFP菌株接种作物种子试验表明其与作物根部有很好的亲和性,对作物生长也有很好的促生效果。经高效液相色谱分析测定发现,GW-1-GFP菌株在各处理土壤条件下25天时降解缩二脲的能力达到50%以上,GW-1-GFP菌株能够在土壤中很好地起到降解缩二脲的效果。通过盆栽试验发现GW-1-GFP菌株能够很好地缓解缩二脲对作物的毒害作用,与CK相比,添加GW-1-GFP菌株后,促进K、P元素的吸收。