目的:本实验研究以本课题组前期构建及鉴定的新型结核病疫苗菌株（B/R菌株）为研究对象,比较研究BCG菌株、H37Ra菌株和B/R菌株对T细胞免疫记忆的影响,探讨研究B/R菌株的抗结核免疫保护作用及其机制,为B/R菌株作为新型结核病疫苗菌株提供理论依据。方法:1.疫苗菌株的制备:BCG、H37Ra菌和B/R菌株分别接种于改良罗氏培养基上,培养3周,制备成1?10⁷CFU/m L菌悬液。2.动物分组及免疫:分为PBS组、BCG组、H37Ra组和B/R菌株组。分别采用相应菌株的菌悬液,皮下注射,单次免疫C57BL/6小鼠（1?10⁶CFU/100u L/只）,PBS组,注射等体积PBS作为阴性对照。3.免疫小鼠后,评价B/R菌株对T细胞免疫记忆的建立和维持的影响:免疫小鼠后8周、12周和16周时,收集小鼠血清及脾淋巴细胞。应用ELISA方法,检测免疫小鼠血清中IL-2、IFN-γ的水平;应用流式细胞技术,检测免疫小鼠脾脏CD4⁺和CD8⁺T细胞中效应型记忆性淋巴细胞(T_EM)和中央型记忆性淋巴细胞(T_CM)的水平。4.特异性抗原刺激后,评价B/R菌株对记忆性T细胞的影响:免疫小鼠后8周、12周和16周时,提取小鼠脾淋巴细胞,体外PPD刺激并培养,收集细胞上清及细胞。应用ELISA方法,检测小鼠脾淋巴细胞分泌的抗原特异性Th1/Th2型细胞因子的水平;应用流式细胞技术,检测经PPD刺激后,CD4⁺和CD8⁺T细胞中T_EM和T_CM的水平;应用CFSE标记法,检测CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞的增殖能力。5.评价B/R菌株免疫小鼠后的短期免疫保护效果:通过HE染色法判断小鼠肺脏和脾脏病理损伤程度;通过脏器组织中的菌落数（CFU）计数,分析疫苗免疫后对结核分枝杆菌的清除能力。结果:1.B/R菌株对小鼠T细胞免疫记忆的建立及维持的影响:免疫小鼠后8周时,B/R菌株组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平,高于BCG组（P（27）0.05）;与H37Ra组相比较,无统计学差异。免疫小鼠后12周时,B/R菌株组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平,与BCG组和H37Ra组相比较,均无统计学差异。免疫小鼠后16周时,B/R菌株组小鼠血清IFN-γ水平高于BCG组（P（27）0.05）;与H37Ra组相比较,无统计学差异;B/R菌株组小鼠血清IL-2水平,与BCG组和H37Ra组相比较,均无统计学差异。免疫小鼠后8、12、16周时,与PBS组相比较,B/R菌株组的CD₈⁺T_CM除12周时有所降低外,CD4⁺、CD8⁺T细胞中T_CM及T_EM数,均显著升高（P（27）0.05）。随免疫时间延长,与BCG组相比较,B/R菌株组在16周时可维持更高水平的T_EM（P（27）0.05）。2.特异性抗原刺激后,B/R菌株对小鼠T细胞免疫记忆的影响:在免疫后的早期（即8周时）,各疫苗组脾淋巴细胞分泌的抗原特异性Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2水平,差异无统计学意义。免疫小鼠后12周时,B/R菌株组分泌的抗原特异性IFN-γ水平,高于BCG组（P<0.05）;此时的IL-2水平略高于BCG组,但差异无统计学意义。随免疫时间的延长,B/R菌株分泌的IFN-γ和IL-2,在16周时均显著高于BCG组和H37Ra组（P<0.05）。各时间点,Th2型细胞因子IL-4的含量在四组之间均无统计学差异。免疫小鼠后8周时,B/R菌株组CD4⁺、CD8⁺的T_CM和T_EM水平,与BCG组相比较,无统计学差异;与H37Ra组相比较,CD4⁺T_EM有所降低（P<0.05）。免疫小鼠后12周时,B/R菌株组CD4⁺T_CM和T_EM以及CD8⁺T_CM水平,与BCG组和H₃₇Ra组相比较,无统计学差异,CD8⁺T_EM高于BCG组和H₃₇Ra组（P<0.05）。随时间延长,免疫小鼠后16周时,B/R菌株组的CD4⁺、CD8⁺T_CM和T_EM水平,均显著高于BCG组（P<0.05）。B/R菌株组的CD4⁺、CD8⁺T细胞增殖率,在16周时均明显高于BCG组和H37Ra组（P<0.05）。3.B/R菌株免疫小鼠后的短期免疫保护效果:B/R菌株组小鼠肺脏和脾脏组织的病理损伤程度,与PBS组相比较,显著减轻;与BCG组相比较,病理变化相当。B/R菌株组肺脏和脾脏的菌落数,与PBS组比均明显减少（P<0.05）;但各疫苗组间的CFU计数,差异无统计学意义。结论:1.B/R菌株免疫小鼠后,可建立较高水平的免疫保护性记忆细胞,以T_EM为主。2.B/R菌株通过唤醒较高水平的记忆性T细胞,以及产生以Th1型为主的免疫应答,发挥免疫保护作用,其免疫记忆至少可维持近4月。3.B/R菌株继承了亲代BCG预防原发感染的优势,具有较好的免疫保护效果,是一种有潜力的结核病疫苗。