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糖尿病(diabetes Mellitus, DM)及其并发症严重危害人们健康及生存质量。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是DM最严重的并发症之一,也是糖尿病患者重要的死亡原因。较高的血糖水平可以诱导肾小管上皮细胞向间质转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)成肌成纤维细胞(myofibroblast, MyoF)。MyoF作为组织纤维化的效应细胞,直接参与肾小管间质纤维化(tubular interstitial fibrosis, TIF)过程。“三黄泻心汤”亦称“泻心汤”,出自《金匮要略》,由黄连、大黄、黄芩三味中药组成,具有泻火解毒、清热燥湿、除痞止血之功效,是中医临床治疗胃火邪内炽证的常用方剂。泻心汤具有多种药理作用,现代临床应用于急性胃肠炎、肝炎、胆囊炎、口腔炎、痢疾以及外科疮疡,凡属心胃火盛者,均可用本方加减治疗。目前泻心汤已临床应用于糖尿病肾病的治疗,但其机制尚未完全阐明。整体动物研究证实,该方具有降低血糖的作用,其抗糖尿病肾病作用是否独立于降血糖作用值得关注。本课题拟通过研究泻心汤有效成分对高糖诱导的肾小管上皮HK-2细胞氧化应激、转分化及迁移的作用,为探讨泻心汤抗糖尿病肾病的物质基础及作用机理提供实验依据。第一部分泻心汤有效成分对高糖诱导HK-2氧化应激的影响目的：研究泻心汤的有效成分大黄酸、小檗碱和黄芩苷对高糖诱导的HK-2细胞抗氧化应激的作用。方法：体外高糖培养HK-2细胞,药物处理组加入不同浓度的大黄酸、小檗碱和黄芩苷,孵育24h后收集细胞上清,采用硫代巴比妥酸法检测MDA的含量,黄嘌呤氧化酶法检测SOD活力。结果：1、高糖作用HK-2细胞24h后,其上清液中MDA含量比正常组(NG)升高了25.21%(p<0.01),渗透压对照组(MAN)无明显变化。药物干预后,与高糖组(HG)相比,大黄酸2μg/ml、5μg/ml组细胞上清MDA含量分别降低6.16%、18.90%(p<0.05或p<0.01),小檗碱2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml组细胞上清MDA含量分别下降12.24%、20.95%、9.53%(p<0.05或p<0.01),黄芩苷2μg/ml、5μg/ml10μg/ml组细胞上清MDA含量分别下降21.45%、15.04%、18.41%(p<0.05或p<0.01)。2、高糖作用HK-2细胞24h后,细胞上清液中SOD酶活力比NG下降了27.96%(p<0.01),MAN组无明显变化。药物干预后,与HG组比相,大黄酸5μg/ml、10μg/ml组SOD酶活力分别升高了21.41%、27.37%(p<0.05或p<0.01),小檗碱2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml组SOD酶活力分别升高了23.15%、28.12%、30.02%(p<0.05或p<0.01),黄芩苷2μg/ml、μg/ml、10μg/ml组SOD酶活力分别升高了40.59%、27.35%、38.52%(p<0.01)。结论：泻心汤的三个有效成分大黄酸、小檗碱和黄芩苷均可提高SOD的活性及减少MDA的产生,提示泻心汤可通过抑制高糖诱导的氧化应激发挥肾保护作用。第二部分泻心汤有效成分对高糖诱导HK-2的转分化作用的影响目的：研究泻心汤有效成分大黄酸、小檗碱和黄芩苷对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)的转分化作用。方法：1、体外高糖培养HK-2细胞,药物处理组加入不同浓度的大黄酸、小檗碱和黄芩苷(2μg/ml、μg/ml、μg/ml),孵育48h后western blot法检测α-SMA蛋白的表达变化。2、体外培养HK-2细胞,显微镜观察高糖(30mmol/L)及大黄酸、小檗碱、黄芩苷分别为5μg/ml时对细胞形态的影响。结果：1、NG组α-SMA蛋白微量表达,MAN组与NG组相比α-SMA表达未见显著性差异,高糖刺激48h后α-SMA表达与正常组相比升高了20.03%(p<0.01)；与HG组相比,大黄酸(2μg/ml、μg/ml、μg/ml)(?)明显抑制高糖诱导的α-SMA蛋白表达,分别下降11.67%、13.33%、12.50%(p<0.05或p<0.01)；小檗碱(5μg/mlμg/ml、1μg/ml)能明显抑制高糖诱导的α-SMA蛋白表达,分别下降10.05%、17.65%(p<0.05或p<0.01)；黄芩苷(5μg/ml、μg/ml)能明显抑制高糖诱导的α-SMA蛋白表达,分别下降9.09%、11.88%(p<0.05或p<0.01)。2、正常的HK-2细胞间连接紧密,呈铺路石样排列。甘露醇对细胞形态无明显影响。高糖刺激48h,细胞形态发生明显改变,拉长为梭形,排列不紧密。大黄酸、小檗碱和黄芩苷组视野下梭形细胞数目明显减少,可见铺路石样细胞。结论：泻心汤的三个有效成分大黄酸、小檗碱和黄芩苷均可下调α-SMA蛋白表达,提示泻心汤可能具有不依赖于调控血糖的直接肾保护作用。第三部分泻心汤有效成分对高糖诱导HK-2迁移的影响目的：研究泻心汤有效成分对高糖诱导的HK-2细胞迁移的抑制作用和机制。方法：1、体外高糖培养HK-2细胞,大黄酸、小檗碱和黄芩苷干预10d, transwell实验检测细胞迁移能力。2、体外高糖培养HK-2细胞,药物处理组加入不同浓度的大黄酸、小檗碱和黄芩苷,western blot方法检测FAK蛋白表达。结果：1、transwell实验中,与正常组(10.47±1.33细胞数/视野)相比,渗透压对照组细胞迁移没有明显变化(10.60±1.56细胞数/视野),高糖刺激10d后细胞迁移显著增加(66.47±7.29细胞数/视野,p<0.01),为NG组的6.35倍；大黄酸(5μg/ml)、小檗碱(5μg/ml)、黄芩苷(5μg/ml)能显著抑制高糖诱导的细胞迁移(45.53±9.72、17.73±3.48、19.93±4.39细胞数/视野,p<0.05或p<0.01)。2、与NG组相比,MAN组FAK蛋白表达未见显著性差异,高糖刺激7d后FAK表达明显升高了28.73%(p<0.01)；与HG组相比,大黄酸组FAK蛋白表达无明显变化；小檗碱5μg/ml、10μg/ml组FAK蛋白表达分别降低22.18%、26.59%(p<0.05或p<0.01)；黄芩苷5μg/ml、10μg/ml组FAK蛋白表达分别降低25.18%、22.93%(p<0.01)。结论：泻心汤的三个有效成分大黄酸、盐酸小檗碱和黄芩苷均可抑制高糖诱导HK-2细胞迁移,提示泻心汤可通过抑制肾小管上皮细胞迁移发挥肾保护作用。其中,小檗碱和黄芩苷可以下调FAK表达,提示下调FAK表达可能是泻心汤对抗肾小管上皮细胞迁移的作用机理之一。