小麦籽粒LOX活性的检测方法及在种子形成发育和萌发期间的变化

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本文选用4个脂肪氧化酶活性较稳定的小麦品种(系)为试验材料,进行了小麦LOX活性检测方法的优化试验,初步分析了小麦脂肪氧化酶的酶学特性,分别分析了籽粒成熟、萌发期间脂肪氧化酶同工酶的变化;选用14个脂肪氧化酶活性差异较大的小麦品种(系),分析了小麦干种子中脂肪氧化酶同工酶的存在情况。通过以上试验,得出以下结果:1.在小麦LOX活性检测方法的优化的单因素试验中,对最适全麦粉用量、最适底物亚油酸浓度、最适提取温度、最适冰浴抽提时间、最适缓冲液pH值分别进行了测定。在最适全麦粉用量测定的试验中,配置了0.04g/ml、0.08g/ml、0.12g/ml、0.16g/ml、0.2g/ml、0.24g/ml、0.28g/ml、0.32g/ml、0.36g/ml、0.4g/ml的全麦粉提取体系,测得的最适全麦粉用量范围为0.2g/ml左右;在最适底物亚油酸浓度测定的试验中,将粗酶提取体系分别置于亚油酸浓度为0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%的底物中进行反应,测得的最适底物亚油酸浓度为0.05%左右;在最适提取温度测定的试验中,将粗酶提取体系分别置于0℃,5℃,10℃,15℃,20℃,25℃,30℃和35℃条件下浸提1h后,测定每提取体系的上清液LOX活性,测得的最适提取温度为5℃左右;在最适冰浴抽提时间的试验中,设置了10min、30min、60min、90min、120min、150min、180min的浸提时间,测得的最佳冰浴抽提时间为30min左右;在最适缓冲液pH值的试验中,分别配置了pH为3、4、5、6、7、8的缓冲液,测得的最适缓冲液PH值为6.0左右。在单因素试验结果的基础上,设计了四因素三水平正交试验,经极差法分析得到的最优组合是在底物亚油酸浓度为0.05%,全麦粉用量为0.2g/ml,PH值为7,冰浴抽提时间为30min。2.研究小麦种子LOX的酶学特性的试验中,将反应体系的pH值分别微调为3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0、7.6、8.0,测得最适pH为6.0;分别控制反应温度为20℃、30℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、90℃,得到最适反应温度为30℃。利用双倒数作图法测定得到小麦脂肪氧化酶反应的米氏常数Km=5.61mol/L,最大反应速度为Vmax=0.61mol/L·min,相应的动力学方程为:v=0.611·[s]/(5.61+[s])3.供试的14个小麦品种干种子等电聚焦电泳图中均有条带且均存在于碱性区段,其中前7个品种(内乡188、陕228、蒿优9409、太空35、扬麦93111、安农9403、小冰33)的LOX酶活性平均值是5.31AU·min-1·g-1为较低LOX活性的品种,其条带都为上下两条;后7个品种(鲁麦22、济麦21、郑9405、安农糯1、内白、W1032、鹤麦026)的LOX酶活性平均值是14.95为较高LOX活性的品种,其条带都为上中下三条。由此可以看出,高LOX活性的小麦品种比低LOX活性的种子中多出一条同工酶条带,即多出一个LOX同工酶。4.在小麦籽粒成熟期,中优9507、内乡188、蒿优9409含有5条不同的同工酶条带,鲁麦22含有8条不同的LOX同工酶条带,随籽粒成熟度的增加酸性和中性部分的LOX同工酶的合成与含量逐渐减少,碱性部分的LOX同工酶的合成与含量缓慢增加,成熟末期小麦种子积累的是碱性LOX;4个品种的LOX活性均呈现先降低至最低点后轻微反弹的变化,花后5d-15d酸性LOX活性高,而成熟中后期碱性LOX活力较高。在种子萌发期间,4个小麦品种都含有7条LOX同工酶条带,除萌发第一天外,随种子萌发的进行,酸性部分的LOX同工酶合成与含量减少,碱性和中性部分的LOX同工酶合成与含量逐渐缓慢增加,随着萌发的进行小麦种子主要积累碱性LOX;4个品种的LOX活性均呈现先保持一恒定高值后迅速下降至一恒定低值的变化,种子萌发至发芽后2d-3dLOX活力维持在一恒定高值,但随脂肪含量的减少,LOX活力也迅速降低;4d-5d酸性LOX活力高,而5d-7d碱性LOX活力较大。籽粒成熟期间和种子萌发期间影响LOX活性的主要是酸性的LOX同工酶。
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