慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)是常见的人类口腔疾病之一。牙周炎的发生发展受到多种因素的影响。近年研究表明,牙周炎发生是由于牙周局部免疫防御机制的抑制而使得牙周致病菌定植、繁殖,所产生的多种毒力因子可诱导宿主细胞释放多种炎性细胞因子或化学介质,从而致使局部的细胞毒性和免疫病理变化,导致牙周组织破坏。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)是革兰阴性厌氧杆菌,被认为是慢性牙周炎的重要的致病菌。可以从慢性牙周炎病人的牙周袋内分离得到该菌。该菌可产生一系列逃避宿主免疫防御机制和破坏宿主组织的毒力因子,如脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、蛋白酶(gingipains)、菌毛蛋白A、胶原酶、凝集素和超氧化物歧化酶等。LPS是革兰阴性菌细胞外膜中的主要结构成分,是一类具有广泛的生物学活性和毒性的大分子物质,能够诱导多种细胞分泌多种炎症因子,从而导致牙周组织的破坏,被认为是革兰阴性菌的主要毒力因子之一。有研究证实,Pg-LPS的结构具有特殊性,所诱导的宿主细胞炎症反应的信号通路与大肠杆菌脂多糖(lippopolysacchride of Escherichia coli,E-LPS)有所不同。目前Pg-LPS诱导牙周炎症的信号传导通路尚不明了,是否具有不同于E-LPS的特点也不得而知。Pg蛋白酶(gingipains)也在牙周致病过程中占据了一个重要地位,是一类结构和功能十分相似的蛋白质,具有多种生物学活性,并具有很好的免疫原性,可诱导机体的保护性免疫应答,被认为是很有潜力的牙周炎疫苗抗原。蛋白酶在补体系统中有促进和延迟免疫反应双重影响,可能与慢性牙周炎有关。有研究发现gingipains能水解重组LPS的主要受体CD14,从而减弱细胞对细菌的识别,认为该酶抑制CD14依赖的细胞活化及炎症慢性化有关。本研究的目的是:①明确Pg-LPS诱导下单核细胞和中性粒细胞启动炎症反应的受体、主要炎症信号传导通路和诱导炎症因子的能力;②构建gingipains基因原核表达系统,为进一步研究牙周炎疫苗,动物实验和临床实验奠定基础。并初步探索gingipains水解CD14的活性及与慢性牙周炎的关系。上述问题的阐明有助于进一步了解Pg在慢性牙周炎中的发病机制。主要研究内容和结果如下:第一部分牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导细胞分泌炎症因子的能力及相关的toll样受体和胞内信号通路的研究实验一、采用改良的热酚-水法从Pg ATCC 33277株中提取Pg-LPS,并获得纯化后的精制品。采用红外光谱分析Pg-LPS结构、气液色谱法分析Pg-LPS单糖和脂肪酸种类和含量。采用鲎试验检测Pg-LPS的生物活性。结果显示:红外光谱分析显示Pg-LPS与E-LPS基本结构相似,但两者的脂肪酸组成有所差异,所提取的Pg-LPS具有较高的生物活性((?)15.0ng/ml),可用于后续试验。实验二、以人单核细胞THP-1株和人中性粒细胞HL-60株为效应细胞,分别用Pg-LPS和商品化大肠杆菌O111:B4株的脂多糖(E-LPS)刺激后,酶联免疫试剂盒检测IL-6、IL-1β和TNF-α水平。结果显示:①1μg/ml Pg-LPS分别作用0.5、6和6h或1μg/ml E-LPS分别作用6、24和24 h,THP-1细胞分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显升高(P<0.01),但Pg-LPS诱生的上述细胞因子的浓度高于E-LPS(P<0.05)。②1μg/ml Pg-LPS分别作用48、24和48h或1μg/ml E-LPS分别作用48、48和72 h,HL-60细胞分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显升高(P<0.01);但HL-60细胞分泌的上述胞因子最高浓度均明显低于THP-1细胞(P<0.05);E-LPS诱生的TNF-α最高浓度与Pg-LPS相近(P>0.05),但诱生的IL-1β和IL-6最高浓度明显低于Pg-LPS(P<0.05)。实验三、采用TLR2或TLR4抗体阻断试验联合ELISA检测,了解LPS结合靶细胞上Toll样受体的类型。在Pg-LPS或E-LPS作用前先分别加入终浓度为2μg/ml的兔抗人TLR2或TLR4抗体,酶联免疫试剂盒检测IL-6、IL-1β和TNF-α水平的变化,从而确定LPS的主要信号通路受体。同时采用RT-PCR方法检测了LPS处理和非处理的THP-1细胞表面TLR mRNA表达水平的差异。结果显示:①TLR2抗体有明显阻断Pg-LPS诱导THP-1细胞分泌IL-6、IL-1β和TNF-α作用(P<0.05),TLR4也有阻断Pg-LPS诱导THP-1细胞分泌IL-6的作用,但效果不如TLR2。TLR4抗体对E-LPS诱导THP-1细胞分泌三种炎症因子有明显阻断作用(P<0.05),②TLR2抗体对Pg-LPS、TLR4抗体对E-LPS诱导HL-60细胞分泌IL-6、IL-1β或TNF-α作用有明显阻断作用(P<0.05)。③Pg-LPS作用12h后THP-1细胞TLR2的mRNA水平明显增高,其条带显著强于对照,而TLR4的mRNA的水平无显著变化。E-LPS正好与Pg-LPS相反,刺激后TLR4的mRNA水平明显增高。实验四、应用多种胞内特异性阻断剂检测Pg-LPS和E-LPS诱导THP-1和HL-60细胞分泌炎症因子的相关胞内信号传导通路,包括P38MAPK通路阻断剂SB203580、JNK通路阻断剂SP600125和NF-κB信号通路阻断剂SN50。采用特异性的磷酸化试剂盒检测Pg-LPS或E-LPS作用后JNK、P38MAPK和NF-κB磷酸化水平的变化。采用共聚焦显微镜来探测Pg-LPS相关信号通路从胞浆内转入到细胞核内的变化。结果显示:①仅JNK通路阻断剂SP600125能有效抑制Pg-LPS诱导THP-1细胞分泌IL-1β、TNF-α或IL-6(P<0.05),此外NF-κB通路阻断剂SN50作用48 h时也显示对IL-1β的抑制作用(P<0.05);P38 MAPK通路阻断剂SB203580和NF-κB信号通路阻断剂SN50均可抑制E-LPS诱导THP-1细胞分泌上述三种炎症因子(P<0.05)。②JNK和NF-κB通路阻断剂显示抑制Pg-LPS诱导HL-60细胞分泌IL-1β(P<0.05);三条通路阻断剂均能抑制Pg-LPS诱导HL-60细胞分泌TNF-α(P<0.05),但以JNK通路阻断剂作用最强;仅P38MAPK和NF-κB通路阻断剂都可抑制E-LPS诱导HL-60细胞分泌IL-1β、TNF-α和IL-6的作用(P<0.05)。③Pg-LPS和E-LPS作用后,JNK、P38MAPK和NF-κB磷酸化水平均有所提高,但Pg-LPS作用后,JNK磷酸化水平提高最明显,而E-LPS作用后,P38MAPK和NF-κB磷酸化水平提高相对更明显。④共聚焦显微镜实验显示,在Pg-LPS作用下,THP-1细胞内的JNK和NF-κB信号通路都被激活,信号表达转入到细胞核内,进一步说明Pg-LPS诱导炎症因子的信号传导通路是JNK和NF-κB。第二部分牙龈卟啉单胞菌蛋白酶R原核表达系统的构建、蛋白收集、抗血清制备及对THP-1细胞CD14的水解作用。实验一、采用常规的苯酚-氯仿法提取PgATCC33277株基因组DNA,经无DNA酶的RNA酶消化后,再用苯酚-氯仿法将提取的DNA溶于TE缓冲液中作为PCR的模板,用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。结果显示:所提取的DNA制品较纯、浓度较高,稀释成100ug/10ul保存(OD260值为1时相当于50ug/ml的双链DNA,且DNA提取物OD260:OD280≥1.8时认为制品较纯)。实验二、根据报道的rgpAc,rgpBc和hagA的基因序列设计引物,采用PCR扩增rgpAc,rgpBc和hagA基因序列,溴乙锭染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。采用上海申能博彩生物科技有限公司(SNBC)的3s PCR ProductPurification Kit V2.0回收目的扩增片段。目的扩增片段连接于pUCm-T载体中,形成用于测序的pUCm-T-rgpAc,pUCm-T-rgpBc和pUCm-T-hagA重组质粒。转化至E.coli DH5α中,经蓝白筛选的阳性克隆扩增后用碱变性法提取重组质粒,双酶切鉴定后用双脱氧链末端终止法测定插入片段的核苷酸序列。测序对比序列后,再进行亚克隆,转化于E.coli BL21DE3工程菌,得到pET-42a-rgpAc BL21DE3,ET-42a-rgpBc BL21DE3和pET-42a-hagA BL21DE3。然后扩增、提取质粒后再次测序。结果显示:①从Pg ATCC 33277基因组DNA模板中扩增获得rgpAc,rgpBc和hagA目的条带大小分别为1479bp,1305 bp和2961bp。②T-A克隆双酶切结果的目的片段及载体位置吻合。③从Pg ATCC 33277株DNA模板中扩增的RgpAc,RgpBc和HagA基因分别与已报道的基因序列进行比较,核苷酸序列和氨基酸序列的同源性都>97%。实验三、0.5mmol/L IPTG诱导原核表达系统pET-42a-rgpAc BL21DE3,ET-42a-rgpBc BL21DE3和pET-42a-hagA BL21DE3中的重组蛋白rRgpAc,rRgpBc和rHagA。采用SDS-PAGE检查重组蛋白的分子量。采用Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白。以纯化的重组蛋白免疫家兔后获得抗血清,并用Western blot检测rRgpAc,rRgpBc和rHagA的免疫原性和免疫反应性。结果显示:①0.5mmol/L IPTG能够诱导重组蛋白rRgpAc,rRgpBc和rHagA的表达。纯化后的rRgpAc、rRgpBc和rHagA,在SDS-PAGE上各目的重组蛋白均仅见单一的条带。Western blot结果表明,rRgpAc、rRgpBc和rHagA能与兔抗Pg全菌抗血清结合,也能与其诱导家兔产生的相应抗体结合,提示rRgpAc、rRgpBc和rHagA有良好的免疫原性和免疫反应性。实验四、用rRgpAc和rRgpBc蛋白作用于人单核细胞THP-1株,用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测细胞膜表面CD14表达的变化。结果显示:分化成熟的THP-1细胞可表达一定量的CD14,当0.5μM rRgpAc或rRgpBc作用于THP-1细胞30min后,CD14的表达量明显减少,作用120min后,基本完全水解了THP-1细胞膜表面的CD14。提示Rgp可能有使LPS诱导的炎症慢性化的作用。结论:1.Pg-LPS与E-LPS基本结构相似,但在脂肪酸组成成分上有差异,可能是导致两者信号通路差异的原因。2.Pg-LPS能够诱导THP-1和HL-60细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6。Pg-LPS或E-LPS作用的THP-1细胞上述细胞因子水平明显高于HL-60细胞,提示不同细胞对Pg-LPS或E-LPS刺激的反应有明显差异。3.与E-LPS受体为TLR4不同,Pg-LPS的细胞表面受体主要应是TLR2,同时也可为TLR4,而TLR2或TLR2/TLR4作为Pg-LPS受体与细胞种类有关。4.Pg-LPS调节同一靶细胞不同细胞因子合成的胞内信号传导通路与E-LPS明显不同,调节同一细胞因子合成的胞内信号传导通路也可因靶细胞不同而有明显差异。JNK可能是Pg-LPS的主要的信号传导通路,同时NF-κB也参与Pg-LPS诱导的细胞炎症信号通路。而P38MAPK和NF-κB是E-LPS主要的信号传导通路。5.成功构建了RgpAc,RgpBc和HagA基因原核表达系统,为进一步研究相关疫苗和免疫机制奠定了基础。6.rRgpAc和rRgpBc蛋白酶能够降解LPS的信号受体CD14,gingipains与LPS之间的交叉反应,很可能是Pg导致牙周慢性炎症的机制。