论文部分内容阅读
尽管人们对肝细胞癌外科的手术治疗、全身的系统治疗的体系的逐步的完善,同时也随着对分子病理生理机制水平深入的基础研究,对于肝细胞癌的认识越来越清晰,但目前并没有改变肝细胞癌发病率逐渐升高、死亡率仍在升高的这个趋势,仍需要在肝细胞癌发生机制方面做深入研究,尤其是肝细胞癌细胞的DNA复制的启动点的研究需要更加深入。DNA合成酶的作用是开始DNA合成。真核细胞核DNA引物合成酶含有PRIM1和PRIM2 2个亚基。PRIM1是异四倍体真核生物多醚菌素α/引物酶合成物最小亚基,它单独携带有酶的催化作用和引物的延伸作用,然而PRIM2基于完全没有这些酶的活性作用。在整个细胞周期过程中,PRIM1基因的mRNA水平的表达是不断调整的,没有PRIM1基因的催化作用,DNA的起始点的复制是无法进行的,所以PRIM1基因在肿瘤的形成过程中扮演非常重要的角色,目前已有在膀胱癌、乳腺癌、骨肉瘤等肿瘤细胞中是报道。很多微点阵研究证实细胞循环周期的异常在肝细胞癌是一个连贯事件,PRIM1突变影响细胞循环周期G1到S期过渡。Wurmbach等研究证实PRIM1基因可以作为早期肝细胞癌的潜在的标记物,在肝细胞癌发展过程中的一个重要特征是向上调节的PRIM1基因同时参与细胞的损伤、DNA的修复与复制。鉴于PRIM1参与DNA合成的催化和引物的延伸作用,且已有研究表明在肝肿瘤细胞中PRIM1高表达,本课题组提出PRIM1促进肝细胞癌细胞增殖的假设,我们拟借助TCGA（The Cancer Genome Atlas）肿瘤标本数据库成熟的样本信息,利用生物信息学分析对获得50对配对的肿瘤样本RNAseq数据进行统计分析获得PRIM1基因信息,以实现以下目标:1.利用现有的肿瘤标本数据库,运用生物信息学及统计学分析方法获得PRIM1基因信息同时证明其与临床具有相关性;2.设计PRIM1干扰靶点基因干扰肝细胞癌细胞系,鉴定肝细胞癌细胞增殖情况;3.制备Affymetrix表达谱芯片同时推测PRIM1基因在肝细胞癌形成过程中的信号调控通路等研究。具体包括以下四部分研究内容:一、TGCA肿瘤数据库,获得50对配对的的肝细胞样本信息,利用生物信息学分析获得PRIM1基因信息二、以目的基因PRIM1基因为模板,设计PRIM1基因干扰靶点基因序列,同时进行慢病毒包装获得干扰质粒;三、干扰BEL-7 4 04、SMMC-7 72 1肝细胞癌细胞中PRIM1基因表达,鉴定肝细胞癌细胞增殖情况;四、制备Affymetrix表达谱芯片制备及利用Pathway探索PRIM1基因下游调控蛋白表达检测;目的探寻PRIM1基因在肝细胞癌形成中的作用机制及其临床的意义。方法我们通过癌症和肿瘤基因图谱计划（The Cancer Genome Atlas,TCGA）肿瘤数据库获获得50对配对的肝细胞癌样本RNAseq数据,再利用Trimmed Mean of M-values 进行数据标准化、Biological coefficient of variation 进行数据质控、Log2（Cancer/Normal）过滤等统计学方法获得PRIM1目的基因信息,同时也用Mann-Whitney U检验法对PRIM1基因在不同临床资料的不同水平上的表达水平的差异显著性进行分析,进而说明PRIM1基因不同的临床T分期、N转移、M转移和病理分级分组的患者癌组织中的表达的差异性。以PRIM1目的基因为模板设计并完成其目的基因干扰靶点的序列,获得LV-PRIM1-RNAi质粒,利用慢病毒将获得的干扰靶点质粒转染进入B E L-7 4 0 4、S M M C-7 7 2 1细胞,借助Celigo仪器、Caspase3/7Assay试剂盒、流式细胞仪、MTT测定慢病毒转染后基因敲减效率大于50%的肝细胞癌细胞的增殖及凋亡情况;再将含有干扰靶基因的慢病毒液转染后的B E L-7 4 0 4细胞接种至4周龄的雌性的SCID小鼠的皮下,连续动态观察其注射部位形成的肿瘤重量及荧光的表达量。同时提取慢病毒转染后基因敲减效率大于70%的肝细胞癌细胞的总得RNA制备Affymetrix基因表达谱,利用一体化的在线整合分析软件（IPA）分析转染后的肝细胞癌的基因、蛋白质之间的属性及相互作用关系网络,同时利用Western Blot验证基因与蛋白之间的关系。结果对TCGA肿瘤数据库获得的50对配对的肝细胞癌的样本RNAseq数据,进行TMM、BCV等生物信息学分析,说明获得的肝细胞癌的样本数据具有很高的稳定性,可以用于后续的分析,Log2（Cancer/Normal）分析方法获得PRIM1基因信息;Mann-Whitney U统计学检验方法对PRIM1在不同临床资料的不同水平上的表达水平的差异显示其具有显著的差异性,且PRIM1在不同T分期、N转移、M转移和病理分级分组的患者癌组织中的表达具有显著的差异性,从而也说明PRIM1与肝细胞癌的临床病理分期具有相关性。将以PRIM1目的基因为模板获得的经过基因测序结果正确的干扰靶基因质粒经过慢病毒包装系统转染进B E L-7 4 0 4、S M M C-7 7 2 1细胞后,对于QPCR检测到肿瘤细胞中PRIMI基因敲减效率达50%的肝细胞癌细胞通过Celigo仪器、Caspase3/7 Assay试剂盒、流式细胞仪、MTT测定显示转染后的肝细胞癌细胞的增殖能力减弱、凋亡能力增加;慢病毒转染后B E L-7 4 0 4细胞接种至4周龄的雌性的SCID小鼠皮下,连续动态观察显示转染后干扰组形成的肿瘤重量及荧光的表达量均较对照组减少。Affymetrix表达谱分析、IPA整合软件及Western Blot检测显示下游的PRIM1基因EGR1蛋白表达下调32.2%,WNT5A蛋白表达下调47.2%,IRS1蛋白表达下调37.3%。结论干扰肝细胞癌中PRIM1基因的表达,能够显著抑制肝细胞癌细胞的增殖,同时也促进肝细胞癌细胞的凋亡,PRIM1可能是通过WNT5a蛋白调控通路调节肝细胞癌的增殖与凋亡。