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目的 探讨吴茱萸碱（Evodiamine,Evo）体内外抗肿瘤作用及其作用机制。方法 1.动物整体抑瘤实验方法 昆明小鼠抑瘤实验方法:小鼠左腋部皮下分别接种S180和HepA。灌胃给药,每日1次,连续给药10天。比较药物的抑瘤作用,并求出肿瘤抑制百分率。 2.药物体外抑瘤实验方法 采用MTT法考察不同浓度的Evo对10种人肿瘤细胞株增殖的抑制作用;采用平板集落形成法考察Evo对SPC-Al肿瘤细胞分裂及集落形成能力的影响。 3.细胞周期分布及凋亡检测方法 采用光镜和透射电镜技术,观察Evo引起的SPC-Al肿瘤细胞形态学改变;采用流式细胞术,观察Evo对SPC-Al细胞增殖周期和凋亡的影响;采用ApoAlert Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒,通过流式细胞仪观察Evo对SPC-Al肿瘤细胞早期凋亡的影响;采用琼脂糖凝胶电泳方法和APO-BRDUTM试剂盒应用流式细胞术,检测Evo引起的SPC-Al肿瘤细胞DNA片断化;采用荧光检测法观察Evo对SPC-Al肿瘤细胞Caspase-8,3活力的影响。应用流式细胞术考察Evo对肿瘤细胞线粒体膜电位的影响;采用免疫印记法考察Evo对肿瘤凋亡相关蛋白PARP、Bcl-2、Bax和细胞周期相关蛋白及其激酶cyclin A、B、D、CDK1、2、4、Rb等的影响。 结果 1.动物整体抑瘤实验结果 荷瘤模型动物抑瘤实验,Evo对S180和HepA的生长均具有明显的抑制作用,ig20mg/kg、10mg/kg和5mg/kg Evo,可使抑瘤率达到30～60%左右。 2.药物体外抑瘤实验结果 Evo对10种人体肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用,作用强度依次为:SPC-Al>NCI-H446>MCF-7>Hela>A375-S2>SMMC—7721>K562>HL—60>Swillc>U251。Evo对SPC-Al、NCI-H446、MCF-7、Hela、A375-S2、SMMC—7721、K562、HL—60的抑制作用较强,其IC50均小于20μg/ml。Evo对SPC-Al细胞增殖的抑制作用具有明显的时-效和量-效关系。随着Evo浓度的增加,作用时间的延长,其杀伤SPC-Al细胞的能力也随之增强。其作用24、48、72hr IC50值为9.680、5.060、2.619μg/ml。Evo能明显抑制SPC-Al细胞分裂和集落形成,半数抑制浓度(IC50)为1.323μg/ml。 3.对细胞周期分布及凋亡的影响 细胞形态学改变:光镜下,5μg/ml的Evo处理后,细胞变圆,体积变小,分泌颗粒增多,细胞折光性下降,大部分细胞脱壁,细胞膜完整但出现发泡现象,染色质浓缩致密并分裂成块状,并可见有的细胞呈现为由一个完整细胞变成多个细胞膜完整的胞状小体,即形成凋亡小体。电镜下,加入0.5μg/ml的Evo后,随药物作用时间延长,细胞呈现凋亡改变,细胞脱壁、细胞膜发泡,细胞皱缩、胞浆浓染并有空泡形成,药物作用6hr后即可见吴茱英碱抗肿瘤作用及其作用机制的研究细胞表面微绒毛脱落,胞质内部分线粒体肿胀,晴断裂,有较多溶酶体产生,进一步细胞核小,异染色质趋边凝聚呈块状,已清晰可见细胞膜包裹细胞器或核片段形成典型的凋亡小体。 不同浓度的吴茱英碱在作用24hr后,细胞周期发生了改变。主要作用于G2期,出现了G2期细胞大量滞留的现象,并且随着剂量的增加,这种变化愈加明显。我们也同样看到,随着药物浓度的增加,Sub一Gl期细胞也逐渐增多。与此变化相同的是,0.5陀加1的Evo作用于SPC一Al细胞6,12,18,24hr后,也引起了大量的细胞停滞在G2加期,GO/Gl期的细胞比率下降。Evo对SPC峨l肿瘤细胞的增殖周期的影响具有明显的剂量和时间依赖关系。同样,DNA亚二倍体峰（Sub一G1）即凋亡峰的百分率也明显升高,且与Evo的作用时间呈正相关。 Annexinv一FITc+/PI一双标检测可见,与阴性对照组比较,Evo作用的凋亡细胞百分率明显增多,呈时间依赖性,5瑰/m1的Evo作用 SPC一A1细胞,大约有3溅的细胞发生凋亡,18hr时有约2/3的细胞处于凋亡早期即AnnexinV一FITC+/PI一,0.5瑰/ml的Evo作用于S汽一Al细胞,随着时间的延长,凋亡细胞也逐渐增多,但总体上低于5陀/ml Evo的作用程度。EvQ诱导S代eeAI细胞的早期凋亡不仅具有时间依赖性,也显示出明显的剂量依赖关系。 随着Evo浓度的增加和作用时间的延长,细胞凋亡的DNA碎片呈规律性的增加。EvO在0.5,1,2.5,5,7.5,10瑰/ml浓度下作用于SPCseAI细胞,通过琼脂糖凝胶电泳均检测到DNA断裂所出现的明显阶梯状条带ul edder”,且随着药物浓度的增加,阶梯状条带愈加明显,而阴性对照组无此现象。应用AP(卜BRDU kit,采用流式细胞技术来检测,0.5陀加l的Evo作用于SPC一l细胞0,12,24,48 hr,随着时间的延长,Evo引起的SPCweAI细胞DNA断裂所造成的DNA链3’一0H也逐渐增多。 经过Evo作用后,Cas皿se一8和easpase一3活性均有所增加。在5瑰/ml Evo作用12hr,casPase一3的活性即开始增加,当作用时间达到48 hr时,其活性已增加为阴性对照的2.6倍。在药物作用24hr时,caspase一8才被激活并且活性开始增加,但其活性增加的强度低于easpase一3。首先,easpase一3被激活,进而eas娜se一8的活性开始增力口。 应用Dioce（3）荧光试剂通过流式细胞仪检测Evo诱导的S陀一1肿瘤细胞线粒体膜电位的变化情况。5,10傀/ml的Evo作用于S代一l细胞,在作用12hr时,线粒体膜电位开始下降,在作用36hr时,达到最低值随后膜电位有所恢复。 5,10傀/ml Evo作用于SPC一A一细胞0,12,24,36,4