论文部分内容阅读
目的：构建高表达microRNA15a慢病毒表达载体，靶向抑制Bmi-1基因表达、并建立稳定干扰Bmi-1基因的骨髓瘤细胞株；研究高表达microRNA15a及抑制Bmi-1基因后对骨髓瘤细胞株U266和RPMI8226生物学特性及对硼替佐米敏感性的影响及其机制。方法：设计合成microrRNA15a序列，利用分子克隆技术构建慢病毒表达载体—GV217-mir-15a，空载体作为对照组，分别与包装载体psPAX2及PMD2.G共转染HEK293T细胞，包装出高滴度的病毒颗粒；感染骨髓瘤细胞株U266和RPMI8226，经过流式细胞仪分选获得稳定细胞株。应用real-time PCR从mRNA水平检测microRNA15a、Bmi-1及Bcl-2的表达，应用western blot方法从蛋白水平检测Bmi-1的表达；CCK-8法检测稳定株细胞增殖；流式细胞术(FCM)检测稳定株细胞周期和凋亡的变化；AO/EB染色、Hoechst33258荧光染色法观察稳定株细胞凋亡形态。进一步，采用CCK-8法、FCM和荧光染色法分别从细胞增殖、细胞周期和凋亡等方面研究Bmi-1基因靶向抑制后对骨髓瘤细胞硼替佐米敏感性的影响及其机制。结果：(1)成功构建慢病毒表达载体GV217-mir-15a；(2)成功建立稳定细胞株：real-time PCR检测结果显示：高表达microRNA15a组细胞microRNA15a表达上调，Bmi-1mRNA水平无显著差异，westernblot检测Bmi-1蛋白水平表达下调，所以可以说明microRNA15a在Bmi-1基因翻译水平靶向抑制Bmi-1基因表达。(3)高表达microRNA15a抑制Bmi-1基因后对稳定株细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响：○1CCK-8结果显示：与对照组相比，24～96小时U266及RPMI8226高表达组细胞增殖抑制率分别为9.65～31.81%、12.11～26.59%；○2FCM检测细胞周期结果显示：U266细胞对照组和高表达microRNA15a组G1期细胞比率分别为37.88%±0.60%、41.50%±0.64%；RPMI8226细胞对照组和高表达microRNA15a组G1期细胞比率分别为37.87%±0.60%、45.31%±0.77%；○3FCM检测细胞凋亡结果显示：U266细胞对照组和高表达microRNA15a组的凋亡率分别为37.08%、90.52%；RPMI8226细胞对照组和高表达microRNA15a组的凋亡率分别为44.17%、59.40%；（4）抑制Bmi-1基因，增强骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性：○1不同浓度硼替佐米分别处理对照组和高表达组细胞，72小时后细胞增殖明显受抑制，高表达组联合用药作用更明显，IC50分别为：U266对照组35.95nmol/L，高表达组25.92nmol/L；RPMI8226对照组25.23nmol/L，高表达组19.08nmol/L；○2联合40nmol/L硼替佐米处理48小时，高表达组细胞周期阻滞更明显。U266细胞对照组和高表达组G1期细胞比率分别为44.85%±0.77%、61.23%±0.83%；RPMI8226细胞对照组和高表达组G1期细胞比率分别为56.41%±0.84%、68.96%±0.85%；○3联合40nmol/L硼替佐米处理48小时，高表达组细胞凋亡率增加。U266细胞对照组和高表达组的凋亡率分别为60.21%、90.57%，RPMI8226细胞对照组和高表达组的凋亡率分别为69.80%、86.17%。结论：(1)M icroRNA15a靶向抑制Bmi-1基因后抑制骨髓瘤细胞增殖，促进凋亡，细胞周期阻滞于G1期；(2) Bmi-1被靶向抑制后增强骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性，Bmi-1基因是microRNA15a的一个目标靶基因，也可能成为MM基因治疗的一个有效靶点。