研究背景上世纪80年代,有研究者将经丝裂霉素C处理后的肿瘤细胞作为饲养层细胞与胚胎共培养,可以提高胚胎的卵裂率及囊胚的形成率,为早期胚胎发育和胚胎植入的研究提供了理想模型。但是,失去恶性的肿瘤细胞与胚胎共培养的模型无法满足研究胚胎与恶性肿瘤相互作用的要求。为此,本实验室后晓南等首次将未经任何处理的人肺癌上皮细胞株A549与小鼠囊胚进行体外共培养,发现胚胎在肿瘤细胞层上粘附、扩展,将肿瘤细胞阻止在自己的空间之外。该共培养模型的建立,使胚胎与真正的恶性肿瘤相互作用成为可能,是胚胎与肿瘤相互作用研究中的一大突破。随后,李大强、王焕英等应用该共培养模型,发现胚胎在体外侵袭恶性肿瘤细胞现象是普遍存在的,并对其机制进行了探索。肿瘤侵袭正常组织与胚胎着床过程有着相似方式及其侵袭机制。二者在病理生理过程、侵袭相关基因表达等方面极为相似。大量研究发现肿瘤与早期胚胎细胞共同表达多种标志物,比如整合素、焦点粘附激酶FAK、基质金属蛋白酶MMP-9、CD44、OCT-4等,因此,给在共培养体系中准确、清晰区别两种相互作用的细胞生命形态、分子表达带来了困难。由此看来,早期胚胎与肿瘤的高度相似性,阻碍了利用该模型进行深入的研究。因此,寻找更具特异性的细胞识别标志以分辨来源于肿瘤与胚胎的细胞或分子表达迫在眉睫。绿色荧光蛋白(Green Florescent Protein, GFP)在荧光显微镜下即可被观察到,且可在多种异源生物中稳定表达而无细胞毒性,被广泛用于各种细胞标识。本研究拟借助基因转染技术,用绿色荧光蛋白稳定标记小鼠恶性黑色素瘤细胞后与小鼠囊胚共培养,以优化小鼠囊胚与恶性肿瘤细胞共培养的模型,也可能为胚胎与肿瘤共培养模型带来新的突破。研究目的1.通过基因转染技术,将EGFP(增强型绿色荧光蛋白)基因转染进入来源于C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤细胞,筛选出稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP-B16细胞株。2.用EGFP-B16细胞与C57BL/6小鼠囊胚共培养,优化小鼠囊胚与肿瘤细胞体外共培养模型。研究方法1.提取EGFP质粒,用GenEscortⅡ转染试剂将质粒转染进入小鼠黑色素瘤细胞B16中,通过G418筛选联合单克隆挑选,获得阳性表达克隆,扩大培养。2.对获得的EGFP-B16细胞进行生物学特性研究:通过激光共聚焦显微镜观察细胞形态,RT-PCR检测细胞内EGFP基因的mRNA表达,流式细胞仪检测EGFP基因的蛋白表达,MTT法研究其体外增殖规律,活体接种检测其在体内的增殖速度及致瘤能力。3.将稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP-B16细胞与小鼠囊胚共培养,与NIH-3T3小鼠成纤维细胞共培养。同时对照B16细胞与小鼠囊胚共培养,NIH-3T3细胞与小鼠囊胚共培养。结果1. EGFP基因转染后,约50%的小鼠黑色素瘤细胞B16在荧光显微镜下发出绿色荧光。通过G418筛选联合单克隆挑选,获得了稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP-B16细胞株。2.培养20代以后,EGFP-B16细胞在激光共聚焦显微镜下发出亮绿色的荧光,普通显微镜下其形态与B16细胞相似,RT-PCR检测到EGFP-B16细胞内有EGFP基因mRNA的表达,流式细胞仪检测到EGFP-B16细胞表达绿色荧光蛋白的阳性率为99.88%。MTT结果显示,EGFP-B16细胞体外增殖规律与B16细胞相似(p﹥0.05)。活体接种结果显示,EGFP-B16具有体内成瘤的能力,但是其在体内的增殖速度较B16细胞慢(p﹤0.05)。3.在EGFP-B16细胞与小鼠囊胚共培养模型中,在激光共聚焦显微镜下能清晰分辨出有荧光的肿瘤细胞和无荧光的胚胎细胞之间的界限。在EGFP-B16细胞与NIH-3T3细胞共培养模型中,能清晰显示出肿瘤细胞侵袭正常细胞形成“癌巢”的现象。而对照组的B16细胞与小鼠囊胚共培养模型中,肿瘤与胚胎之间的界限不清;NIH-3T3细胞与小鼠囊胚共培养中二者界限亦不清。结论基因转染后,以G418抗生素联合单克隆挑选的方法筛选,可建立稳定的EGFP-B16细胞株。基因转染后, EGFP-B16细胞的生物学特性与B16细胞相似。EGFP-B16细胞与C57BL/6小鼠囊胚共培养,更直观的显示了小鼠囊胚与肿瘤细胞共培养时二者的相互作用。EGFP-B16肿瘤细胞与胚胎共培养模型更具直观性,可用于对胚胎与肿瘤相互作用的进一步研究。