高密度脂蛋白（HDL）可通过参与机体胆固醇逆转运、抗氧化、抗炎症等过程发挥心血管保护作用。而在疾病或病理状态下,氧化应激产物蓄积于HDL颗粒并对其产生损伤性修饰,HDL脂质及蛋白质组成发生改变,处于“失功能”状态。ATP结合盒转运蛋白G1（ABCG1）是一种跨膜转运体,可介导细胞内的磷脂及胆固醇（特别是氧化固醇）转运至细胞外的脂质接受体HDL以调控细胞脂质稳态。在课题组前期对ABCG1 rs57137919位点多态性研究中发现,-367G＞A人群冠心病风险显著降低可能与其ABCG1低表达导致单核细胞凋亡加速相关。我们亦在体外细胞系中证实ABCG1敲低促进细胞的凋亡,氧化固醇类物质外流减少并于细胞内蓄积。结合既往报道,目前研究者们认为ABCG1低表达的抗动脉粥样硬化作用与细胞内蓄积的氧化固醇诱导促凋亡基因上调及脂代谢的代偿机制密切相关。然而,ABCG1低表达及继发的氧化固醇外流的改变是否导致HDL粒径、组成及功能的变化尚不明确。本研究拟通过分离ABCG1敲除小鼠血浆HDL对其脂质、蛋白质组成及相关功能进行探究,并关注氧化应激产物7-酮基胆固醇（7-KC）的潜在相关性,以从HDL的角度阐述ABCG1在动脉粥样硬化中的作用机制。一、研究目的1.探究普通及高脂饮食模式下ABCG1敲除对小鼠血浆HDL颗粒大小、氧化固醇含量、胆固醇及游离胆固醇组成、蛋白质成分及含量的影响。2.探究普通及高脂饮食模式下ABCG1敲除对小鼠血浆HDL介导胆固醇外流能力、抗氧化、抗炎症及功能相关酶活性的影响。二、研究方法1.通过PCR电泳对纯化建系的ABCG1敲除小鼠及野生型对照小鼠进行基因型鉴定,将12周龄敲除小鼠及对照组随机分为普通饮食及高脂饮食组给予12周饮食干预,通过密度-梯度离心法分离提纯小鼠血浆HDL,并利用非变性PAGE凝胶电泳及动态光散射（DLS）技术对样本及纯度进行鉴定。2.利用DLS技术对不同饮食ABCG1敲除小鼠及对照组血浆HDL样本粒径进行评估,Amplex Red对样本胆固醇及胆固醇酯化程度进行检测,内标法LC-MS/MS对HDL中氧化固醇类物质进行定量,非标法LC-MS/MS对HDL蛋白质种类及含量进行测定并利用生物信息学方法对ABCG1缺失相关的HDL差异蛋白涉及的生物学功能进行分析,并进一步探究HDL样本中7-KC含量与蛋白丰度值的相关性。3.以不同饮食ABCG1敲除小鼠及对照组血浆HDL样本作为NBD-胆固醇标记J774细胞外流孵育液,检测不同样本介导细胞胆固醇外流能力;利用荧光探针DHR123与HDL样本的氧化反应评估不同小鼠HDL的抗氧化能力,利用PON1底物与HDL样本的酶促反应评估不同小鼠HDL颗粒中PON1活性相关的抗氧化能力;通过抗单核细胞趋化试验对比HDL样本抗炎症能力的差异;通过LCAT底物与HDL样本的酶促反应检测HDL颗粒中LCAT酯化功能的差异。三、研究结果1.ABCG1敲除小鼠纯化建系、实验小鼠血生化特征、血浆HDL样本鉴定（1）经PCR鉴定,本研究建系的ABCG1敲除小鼠子代基因型为突变纯合子,纯合突变可稳定遗传。（2）经密度-梯度离心法分离的小鼠血浆HDL样本非变性PAGE电泳呈单一条带,与血浆中HDL迁移位置一致;经DLS分析小鼠血浆HDL样本纯度高。2.ABCG1敲除对小鼠血浆HDL结构及蛋白、脂质组成的影响（1）经DLS分析普通饮食及高脂饮食模式下,ABCG1敲除小鼠血浆HDL粒径与对照组相比无显著差异;同基因型小鼠相比,野生鼠HDL粒径在高脂饮食模式下增大（P＜0.05）,ABCG1敲除小鼠HDL粒径无显著变化。（2）普通饮食ABCG1敲除小鼠血浆HDL胆固醇含量及胆固醇酯化程度高于对照组（胆固醇含量,胆固醇酯化程度:P＜0.05）;高脂饮食小鼠血浆HDL胆固醇含量无显著组间差异,但敲除鼠HDL胆固醇酯化程度亦高于对照组（P＜0.01）。（3）普通饮食ABCG1敲除小鼠血浆HDL颗粒7-KC含量无显著变化;高脂饮食敲除鼠HDL颗粒7-KC含量显著低于对照组。（4）经非标法蛋白质组学分析,普通饮食ABCG1敲除小鼠与对照组相比血浆HDL中丰度值差异蛋白为23种,其中上调蛋白14种、下调9种。对差异蛋白进行生物信息学分析共富集到具有显著统计学意义的GO条目共1 1条,其中与脂代谢相关的条目2个,炎症及免疫过程相关条目3个,氧化应激相关条目1个。KEGG代谢相关通路分析富集到2个具有显著统计学意义的条目,均与机体免疫过程相关。高脂饮食敲除鼠HDL丰度值差异蛋白为18种,其中上调蛋白7种,下调蛋白11种。差异蛋白GO富集分析共得到8个具有显著统计学意义的条目,其中主要包括与甘油三酯代谢相关条目3个,炎症相关过程2个。KEGG代谢相关通路富集到1个与机体免疫过程相关的条目。（5）对小鼠血浆HDL样本7-KC含量及重要结构及功能蛋白丰度值Pearson相关性分析显示,HDL中7-KC与急性时相反应蛋白呈正相关关系,包括血清淀粉样蛋白（SAA1:r=0.802,P＜0.01;SAA4:r=0.647,P＜0.05）,α-1 抗胰蛋白酶家族（A1AT 1-1:r=0.725,P＜0.01;A1AT 1-2:r=0.800,P＜0.01;A1AT 1-4:r=0.743,P＜0.01;A1AT 1-5,r=0.613,P＜0.05）,补体 C3（r=0.625,P＜0.05）,转铁蛋白（r=0.612,P＜0.05）。此外,7-KC含量还与某些载脂蛋白家族成员呈正相关关系（apoA-4:r=0.686,P＜0.05;apoB-100:r=0.813,P＜0.001;apoM:r=0.634,P＜0.05）。经线性回归模型对HDL样本胆固醇及apoA-1含量校准,HDL 颗粒 A1AT 1-2、A1AT 1-4、apoB-100、SAA1 及 SAA4 的含量与 7-KC 含量具有线性相关关系,随着7-KC含量升高上述蛋白丰度升高。3.ABCG1敲除对小鼠血浆HDL功能的影响（1）普通饮食及高脂饮食小鼠HDL介导J774细胞胆固醇外流能力（CEC）无显著组间差异。（2）普通饮食及高脂饮食小鼠HDL抗DHR123氧化能力均无显著组间差异。但在两种饮食模式下,ABCG1敲除小鼠HDL样本抗氧化蛋白PON1酶活性显著高于对照组（普通饮食,P＜0.01;高脂饮食,P＜0.05）。（3）普通饮食ABCG1敲除小鼠及对照组血浆HDL均可抵抗MCP-1诱导的单核细胞趋化,但二者抗炎能力无显著组间差异;高脂饮食负荷下,小鼠血浆HDL亦均具有抵抗MCP-1诱导的单核细胞趋化能力,且ABCG1敲除小鼠HDL干预后向趋化小室下室迁移的细胞数量显著低于野生小鼠HDL干预组（P＜0.01）,敲除鼠HDL抗炎能力显著高于对照组（P＜0.05）。（4）普通饮食小鼠HDL样本LCAT活性无显著组间差异;高脂饮食模式下,ABCG1敲除小鼠血浆HDL的LCAT活性显著高于对照组（P＜0.05）,且LCAT活性与HDL胆固醇酯化程度呈显著正相关性（Pearsonr=0.9450,P＜0.01）。此外,与同基因型小鼠普通饮食模式相比,野生小鼠HDL的LCAT活性在高脂饮食干预下无显著变化,而敲除小鼠HDL的LCAT酶活性在高脂饮食干预下显著增强（P＜0.01）。（5）高脂饮食负荷下,HDL颗粒中氧化固醇含量与其PON1活性及抗单核细胞趋化能力呈显著负相关性（PON1活性:Pearsonr=-0.8413,P＜0.05;单核细胞迁移率:Pearsonr=0.81 17,P＜0.05）。氧化固醇含量与HDL的LCAT活性及胆固醇酯化程度相关系数较大但无显著统计学意义（LCAT活性:Pearsonr=-0.5745,P=0.2331;胆固醇酯化程度:Pearsonr=-0.7220,P=0.1052）。而氧化固醇与 CEC及抗DHR123氧化能力无显著相关性。四、研究结论1.ABCG1敲除可降低血浆HDL氧化固醇含量并导致HDL蛋白质组发生改变,差异蛋白涉及机体脂代谢、免疫及炎症过程及氧化应激过程。HDL中急性炎症相关蛋白及某些载脂蛋白含量改变与氧化固醇有关。2.ABCG1敲除可增强小鼠HDL抗氧化及抗细胞炎症功能,该保护作用与HDL颗粒中氧化固醇含量降低密切相关。此外,ABCG1敲除通过增强HDL中LCAT活性提高HDL胆固醇酯化程度,可能促进机体RCT。上述过程可能是高脂负荷下ABCG1低表达发挥心血管保护作用的细胞外机制。