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已有研究表明,BMP信号通路在通过上皮和间充质相互作用而发育的器官形成中起着重要的作用。最新的研究发现BMP信号途径在牙齿发育中存在着一种不同于BMP/Smad经典信号途径和BMP非经典信号途径的新的调控方式,称为非典型BMP经典信号途径。在非典型BMP经典信号通路中,pSmad1/5/8复合物不依赖Smad4,而与未知的互作蛋白结合入核调控牙齿发育相关基因的表达。解析pSmad1/5/8是与哪种互作蛋白相互作用,目前主要的技术手段是通过亲和纯化技术分离纯化鉴定互作蛋白,由于抗体的特异性和为了能有效高纯度的分离互作蛋白,本课题选用对靶蛋白空间结构影响小且易于检测的亲和标签蛋白HA;并且研究发现在pSmad1/5/8复合物中,Smad1是主要的入核基因;因此本实验利用CRISPR/Cas9技术在不影响Smad1蛋白表达的基础上,分别在小鼠Smad1基因的3’端终止密码子前和人类SMAD1基因的5’端起始密码子后插入HA标签蛋白基因序列,实现HA蛋白与pSmad1/5/8蛋白共表达,从而为后期分离纯化互作蛋白提供实验材料。利用CRISPR/Cas9技术将外源基因敲入基因组的系统中,需要Cas9蛋白、特异识别的sgRNA和带外源基因的同源重组片段donor。为了验证设计的sgRNA和donor的可行性,本实验首先在细胞水平上进行验证实验。在小鼠Smad1基因的终止密码子附近设计2个sgRNA,并构建带有目的sgRNA序列的CRISPR质粒,检测sgRNA的切割效率,实验结果表明2个sgRNA都能准确有效的对Smad1基因进行切割。进一步在Smad1终止密码子前设计带HA标签蛋白基因序列的同源重组片段donor,与sgRNA共转染NIH3T3细胞,实验结果表明HA序列正确插入到Smad1终止密码子前,并与pSmad1/5/8蛋白融合表达。将在细胞水平上验证成功的Smad1 sgRNA和donor与Cas9蛋白共同通过原核显微注射到小鼠受精卵中,实验结果表明成功获得了在Smad1终止密码子前插入HA序列的遗传修饰小鼠。同时,本实验利用CRISPR/Cas9技术成功建立了 SMAD1-HA-Tag人牙间充质细胞培养体系。在人类SMAD1基因起始密码子附近设计3个sgRNA,并构建带有目的sgRNA序列的CRISPR质粒,将质粒分别转染到HEK293T细胞中,对3个sgRNA的切割情况以及脱靶效率进行了检测。实验结果筛选到2个切割效率高,脱靶率低的sgRNA(sgRNA1和sgRNA3)。进一步在SMAD1起始密码子后设计带HA标签蛋白的同源重组片段donor,分别与sgRNA1/3共转染人牙间充质细胞,筛选正确插入HA基因序列的细胞,成功获得在SMAD1起始密码子后正确的插入了 HA基因序列、并与pSmad1/5/8蛋白融合表达的细胞。综上所述,本实验成功构建了 Smad1-HA-Tag遗传修饰小鼠;并建立了SMAD1-HA-Tag人牙间充质细胞培养体系。为后期研究pSmad1/5/8的互作蛋白提供了材料,为解释和阐明新发现的非典型BMP经典信号途径的作用机理奠定基础。