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目的:
RCAS1是一个新的肿瘤相关抗原,在多种恶性肿瘤组织中表达。它参与肿瘤免疫逃逸。
本论文采用多种方法检测多种肿瘤细胞系中RCAS1的表达情况。我们还设计了DNA载体介导的siRNA,抑制MCF-7细胞内RCAS1的表达,来观察T细胞的生长和功能改变。
方法:
1.采用实时定量PCR、Northernblot、免疫组化和ELISA对10个人肿瘤细胞系及2个正常人细胞系RCAS1分子的表达进行了检测。
2.Westernblot检测有效的RCAS1特异性siRNA序列。实时定量PCR和ELISA测量RNA干扰后MCF-7细胞内RCAS1表达抑制的情况。转染RCAS1特异性siRNA质粒的MCF-7细胞,经G418筛选,获得稳定转染的MCF-7细胞株。
3.T细胞培液中分别加入MCF-7和稳定转染的MCF-7细胞上清液,观察T细胞的生长曲线、细胞周期,凋亡率、Caspase-3活性,CD4/CD8分类,以及IL-2、IL-4andIFN-γ浓度。
结果:
1.实时定量PCR及Northernblot结果,除了正常肝细胞(LO2),各肿瘤细胞及正常人胚肾细胞(293)均见RCAS1mRNA表达;免疫组化见各肿瘤细胞和293细胞的细胞膜和细胞浆中均有RCAS1蛋白,但在LO2细胞中未见RCAS1蛋白;除了HuH-7和LO2细胞,其余10个细胞培养上清液中的RCAS1蛋白量均明显高于DMEM全培液(P<0.001)。
2.R1、R2、R3序列能有效地抑制RCAS1表达,其中R2最明显。实时定量PCR结果显示稳定转染的MCF-7-R2细胞内RCAS1的mRNA水平明显低于MCF-7细胞(P<0.01)。根据ELISA测定,MCF-7-R2细胞内RCAS1蛋白表达也明显低于MCF-7细胞(75%)。
3.MCF-7和MCF-7-SC细胞上清液分别加入T细胞培养液后,T细胞生长受抑制,细胞周期停留在S期。T细胞的凋亡率和Caspase-3活性明显提高(P<0.01)。但加入MCF-7-R2上清液的T细胞仍保持正常的生长和增殖。各组CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分比没有统计学差异。MCF-7和MCF-7-SC组的IFN-γ浓度明显低于MCF-7-R2组(P<0.01),但IL-2和IL-4浓度没有变化。
结论:
1.RCAS1广泛于表达在多种肿瘤细胞系中。
2.R2是最有效的RCAS1特异性siRNA序列。
3.抑制RCAS1表达可以有效的恢复T细胞的增殖,减少凋亡,并部分恢复T细胞分泌IFN-γ的功能。