葡萄是世界极为重要的果树作物，遗传背景复杂、育种周期长，因而使得常规育种在葡萄品种改良上受到极大限制。但是随着生物技术的发展，利用体胚进行无性系变异育种和遗传转化为葡萄品种的定向改良以及种质快繁提供了可能。通过体细胞、组织、器官等外植体建立稳定高频的葡萄体胚再生体系是利用体胚进行葡萄品种改良的先决条件。目前有关葡萄体胚再生体系的研究报道较多，但是普遍存在再生效率低、周期长等问题，缺乏对体胚发生影响因素以及发育形态学、组织学等方面系统的认识；有关葡萄体胚发生过程中遗传稳定性分析和利用体胚诱导无性系变异育种方面的报道更是鲜见。为此，建立稳定高频的葡萄体胚再生体系，揭示体细胞无性系变异规律，利用体胚诱导多倍体育种对于葡萄遗传改良、离体快繁和种质保存等方面具有重要的意义。本文主要从体胚发生、影响因子、生理生化变化、胚性基因表达、嵌合体的发生、无性系变异以及遗传稳定性分析的分子标记等方面，对葡萄体胚发生和利用研究进行了综述和讨论。针对前人研究中存在的问题，从三个方面进行了研究：以葡萄未成熟合子胚为外植体，在建立高频体胚再生体系的基础上，对葡萄体胚发育形态学、组织学、细胞超微结构等方面进行了研究；从染色体、DAN含量和分子水平，对体胚再生植株的遗传稳定性进行了分析；通过诱导处理体胚，对体胚再生多倍体植株从染色体和气孔特性方面作了鉴定。这些研究将为进一步利用体胚进行无性系变异育种、遗传转化、人工种子研制和分子生物学等方面的研究奠定基础。本研究取得的主要结果和结论如下：1体胚再生体系建立及其体胚发生的形态学、组织学和细胞超微结构的研究1.1以酿酒葡萄未成熟合子胚为外植体，通过植物生长调节剂、光照、温度等因素的控制，研究了葡萄体胚发生、保存及植株再生。结果表明：以NN为基本培养基，诱导胚性愈伤组织适宜的植物生长调节剂水平是1.0mg／L 2,4-D，诱导率65.8～85.4％；诱导体胚的生长调节剂水平是1.0mg／L NAA+0.5mg／L BA，诱导率10.5～37.5％；体胚成熟及植株再生的生长调节剂水平是0.05mg／L NAA+0.5mg／L BA，成苗率为15.5～42.1％。温度5℃微光(500Lx)条件有利于体胚的保存。1.2体胚细胞超微结构的观察表明：葡萄未成熟合子胚诱导可形成胚性和非胚性两类不同的愈伤组织，前者胞壁规则、核大、胞质浓缩、质膜紧贴细胞壁，胚体内细胞间存在胞间连丝，富含淀粉粒；体胚经胚性愈伤组织产生，起源于愈伤组织表层单细胞。1.3体胚发生形态学和组织学研究表明：葡萄体胚的形成经历了多细胞原胚、球形胚、梨形胚、心形胚和子叶胚5个典型的发育阶段，并发育成正常植株。与此同时，有些体胚发育过程中出现连体胚、芽端畸形胚、超度含水状胚等畸形胚。1.4体胚转化和再生植株研究表明：体胚成熟的标志是叶绿素和子叶的形成；过大过小的体胚都不能很好地再生成苗；即使转接发育进程基本一致的体胚，在随后的培养过程中体胚发育进度也不同步，甚至产生次生体胚。这表明本研究建立的体胚再生体系条件还需进一步优化，以提高体胚再生率和避免畸形体胚的发生。2体胚再生体系遗传稳定性分析2.1选择来自于同一未成熟合子胚诱导的体胚再生的植株，染色体鉴定结果表明，体胚再生植株根尖细胞染色体数与供体母株一致，未检测到其它倍性细胞。2.2采用细胞流式仪自动测定的DAN含量分布情况分析表明，通过体胚形成的再生植株DNA含量与供体母株一致，正常二倍体细胞分别占细胞总数的78.8％和83.5％；四倍体细胞与二倍体细胞DNA含量的比值分别为1.960和1.963，约等与2。虽然二者均存在DNA含量加倍的细胞，分别占检测细胞总数的12.9％和16.5％，这里染色体加倍细胞的存在不能归咎于遗传变异，而与细胞分裂周期有关。2.3通过优化反应条件和筛选随机引物，应用38条引物，对14个再生植株进行RAPD检测。结果有8条引物呈现良好的多态性和稳定性，每条引物扩增出的片段数在3～7条之间，平为5.8条，所得的片段大小介于150～1200bp之间，8条引物产生的46条可读带，与供体母株带型一致。三方面的结果充分说明通过该体系再生植株遗传特性稳定，无体细胞无性系变异的发生。当然，本研究仅从染色体数、核DNA含量和分子水平来判断遗传稳定性是不够的，还需从表型、生理、生化等方面进一步研究。3利用二倍体体胚诱导多倍体植株研究多倍体葡萄因其高产、抗病、粒大、核少的优点受到育种家的重视。其育种手段长期以来主要采用在组织或器官水平上诱导染色体加倍，但存在问题是嵌合体多，效率低。本研究在建立体胚再生体系的基础上，以幼小体胚为外植体，研究了秋水仙素浓度和处理时间对体胚生长发育和诱导染色体变异的影响。结果表明，随浓度和处理时间的增加，体胚发育迟缓，体胚存活率和植株再生率显著下降，但诱导染色体加倍效应增加。随机选取诱导处理获得的29株再生植株，利用染色体计数和细胞流式仪进行倍性分析表明，5株为同质四倍体，染色体数为76，DNA含量也较其对照加倍。诱导体胚染色体加倍最佳的处理浓度是20mg／L，处理1～3d，均可诱导四倍体，诱导率2.7％。以浓度10mg／L处理3d的诱导率为0.7％。对获得的四倍体植株从叶片气孔特性方面研究表明，四倍体植株较二倍体孔径增大，密度降低。植株倍性水平和气孔参数的相关性分析表明，气孔特性可作为诱变植株倍性水平的早期鉴定。综上所述，本研究在建立高频稳定的葡萄体胚发生和植株再生体系的基础上，证实了体胚发生过程中形成的胚性和非胚性愈伤组织在细胞超微结构上有显著的区别，体胚起源于愈伤组织表皮单细胞，其发育阶段具有合子胚形成特点；从染色体、DNA含量和RAPD分子标记方面证实体胚再生植株遗传稳定；充分利用葡萄体胚诱导染色体加倍以获得多倍体植株是可行的。该研究将为进一步开展以体胚为基础的葡萄遗传转化及种质改良等理论和应用研究提供技术平台。