第一部分:ATG4A在胃癌组织中的表达及临床意义目的:研究ATG4A在临床胃癌组织中的表达情况及其与临床病理相关指标的关系。方法:1,选取我科室2010年4月份至2011年5月份在我科室接受胃癌根治手术患者临床标本共计110例,并完整收集患者临床病理资料。采用免疫组织化学染色方法检测ATG4A在胃癌组织原发灶,胃癌侵袭前沿组织,淋巴结转移灶以及癌旁正常组织中的表达情况,并对所有标本进行免疫组织化学评分,比较ATG4A在上述四种组织中的表达差异。2,根据胃癌组织高、中、低三种不同分化程度进行分组,比较ATG4A在不同分化程度胃癌组织中的表达差异。3,根据免疫组化染色强度评分平均值将所有标本分为高表达组和低表达组,比较两组在肿瘤分化程度,肿瘤浸润深度,淋巴结转移,远处转移,年龄,性别等的差异。结果:1,ATG4A在胃癌组织原发灶的表达为7.23±0.43,胃癌侵袭前沿的表达为7.73±0.75,转移淋巴结组织的表达为7.94±0.81,三组之间无统计学差异,p>0.05,但均高于癌旁正常组织(3.57±0.22),差异具有统计学意义,P<0.05。2,ATG4A在低分化组胃癌组织中的表达为9.78±0.83,中分化组胃癌组织中的表达为7.18±0.83,高分化胃癌组织中的表达为6.94±0.62;ATG4A在高分化组与中分化组中的表达无统计学差异,p>0.05,两组均低于低分化组,差异具有统计学意义,P<0.05。3.胃癌组织中免疫组化染色强度平均评分为7.23,据此将所有病例分为高表达组(≥7.23)和低表达组(<7.23),高表达组75例,低表达组35例,结果发现在肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移具有统计学意,P<0.05。而在年龄,性别以及远处转移方面无统计学差异,P>0.05。结论:1,ATG4A在胃癌原发灶、胃癌侵袭前沿组织以及淋巴结转移灶中的表达无显著差异,但均高于癌旁正常组织。2,atg4a表达与肿瘤分化程度呈负相关、而与肿瘤浸润深度以及胃癌淋巴结转移呈正相关,而与年龄、性别以及远处转移情况无相关性。第二部分:atg4a对胃癌细胞干性及上皮间质转化的影响目的:通过体内外实验研究atg4a对胃癌细胞干性以及上皮间质转化的影响。方法:1.过表达及干扰胃癌细胞株的筛选,选取我科室细胞库中不同分化程度的胃癌细胞株,包括mgc-803、mgc-823、mkn-45、mkn-47、sgc-7901共五个细胞株,提取细胞总蛋白,wb检测atg4a的表达量,选取表达最高者进行干扰表达,表达最低者进行过表达。设计3条靶向atg4a基因的干扰序列,常规进行载体,质粒构建,病毒包装,细胞转染,稳定细胞株筛选。并通过real-timepcr,western-blot等方法检测转染前后atg4amrna和蛋白表达的情况,确定转染效果并进行后续实验。实验重复3次。2.atg4a分子对胃癌细胞株侵袭转移能力的影响,实验细胞分为6组,分别为干扰组空白载体、sh-atg4a-1、sh-atg4a-2、sh-atg4a-3、过表达组空白载体、atg4a-oe分别检测atg4a干扰和过表达后的人胃癌细胞株生物学行为的变化。采用划痕试验检测胃癌细胞迁移能力,划痕后测定宽度,36小时后再次测定宽度,迁移率=(0小时划痕宽度-36小时划痕宽度)/0小时划痕宽度×100%。transwell小室检测胃癌细胞侵袭能力的变化,transwell小室上室接种1×105个细胞,以无血清培养基培养,下室加入含血清培养基,24小时后,取出小室,固定染色后拍照,随机选取5个视野,比较穿膜细胞数量的多少并进行统计。实验重复3次。3.研究atg4a分子对胃癌细胞上皮间质转化的影响,实验分组同划痕实验。通过westernblot法,研究以上六组细胞中emt标志物e-cadherin,n-cadherin,vimentin表达变化,将wb条带进行ipp软件进行灰度值比较,并统计。实验重复3次。4.研究atg4a分子对胃癌干性标志物的影响,实验分组同划痕实验。通过westernblot法,研究以上六组细胞中干性标志物sox-2,oct-4,bmi-1的表达变化,将wb条带进行ipp软件进行灰度值比较,并统计。实验重复3次。5.研究atg4a对胃癌细胞成球能力的影响。实验分组同划痕实验。采用低粘附培养皿以及干细胞培养基进行培养,半换液法进行细胞换液,2周后随机选择5个视野,计数直径介于40um-100um之间,结构紧密的细胞球的个数,并进行统计。6.通过对裸鼠尾静脉注射胃癌细胞,6周后处死,取裸鼠肺组织,对比实验组与对照组裸鼠肺组织中肿瘤个数的差异,并将结果进行统计。结果:1.在胃癌细胞系中,恶性程度较高的细胞系mgc-803中高表达atg4a,恶性程度较低的细胞系sgc-7901低表达atg4a,与最低表达的sgc-7901相比,mgc-803表达量为6.23±0.41倍,sgc-7901表达量为1.34±0.09倍,根据此结果,我们分别对这两种细胞系进行干扰和过表达,wb检测干扰和过表达效果可,与对照组相比,三个干扰组atg4a表达分别下降39.4%±2.3%,45.1%±1.9%,28.2%±4.3%;p<0.01;过表达组中atg4a增高52.2%±4.3%,p<0.01。2.划痕试验结果显示,干扰atg4a表达后,胃癌细胞mgc-803迁移能力下将,三个干扰组分别下降25.7%±2.4%,32.5%±4.5%,20.4%±2.3%,p<0.05。过表达atg4a后,胃癌细胞sgc-7901迁移能力上升,与空载体组相比,上升27.1%±3.3%p<0.05。transwell侵袭实验发现,干扰atg4a表达后,胃癌细胞mgc-803侵袭能力下将,三个干扰组分别下降50.2%±6.1%,44.3%±3.8%,46.5%±4.6%,,p<0.05。过表达atg4a后,胃癌细胞sgc-7901侵袭能力上升,与空载体组相比,上升22.5%±1.9%,p<0.05。3.成球培养方法研究发现,干扰atg4a表达后,胃癌细胞mgc-803成球能力下将,与对照组相比,三个干扰组分别下降35.3%±3.3%,42.5%±4.8%,36.5%±3.7%p<0.05。过表达atg4a后,胃癌细胞sgc-7901成球能力上升,与空载体组相比,上升47.5%%±5.9%,p<0.05。4.干扰atg4a表达后,上皮间质转化标志物波形蛋白表达下降,与对照组相比,三个干扰组分别下降22.4%±2.4%,32.5%±3.2%,23.2%±3.7%;n-钙粘蛋白表达下降,与对照组相比,三个干扰组分别下降17.5%±1.3%,22.1%±2.5%,18.3%±1.7%;而e-钙粘蛋白表达上升,与对照组相比,三个干扰组分别上升38.1%±4.7%,30.4%±2.5%,40.2%±3.7%。过表达atg4a后,胃癌细胞sgc-7901上皮间质转化增强,n-钙粘蛋白表达上升37.1%±4.2%,波形蛋白表达上升35.3%±2.6%,而e-钙粘蛋白表达下降22.5%±3.5%,p<0.05。5.干扰atg4a表达后,干性标志物sox-2表达下降,与空载体对照相,shatg4a-1下降22.5%±2.7%,shatg4a-2下降34.1%±3.1%,shatg4a-3下降50.2%±3.7%。干性标志物oct-4表达下降,shatg4a-1下降26.3%±4.1%,shatg4a-2下降48.3%±2.9%,shatg4a-3下降21.5%±2.1%。干性标志物bmi-1表达下降,shatg4a-1下降45.9%±5.7%,shatg4a-2下降36.2%±4.8%,shatg4a-3下降25.4%±2.1%。过表达atg4a后,与对照组相比,干性标志物sox-2表达上升47.3%±4.7%,oct-4表达上升32.8%±3.3%,bmi-1表达上升38.1%±3.1%,p<0.05。6.体内实验研究发现,干扰atg4a表达后,裸鼠肺组织转移灶数量减少,与空载体对照组相比,转移灶个数下降52.4%±5.7%;过表达atg4a后,肺组织转移个数增多,与空载体对照组相比,转移灶增加34.3%±2.9%,p<0.05。结论:1,低分化胃癌细胞株高表达atg4a蛋白;2,atg4a表达与胃癌细胞干性,上皮间质转化能力以及侵袭转移能力呈正相关。3,atg4a能够增强胃癌细胞在裸鼠体内侵袭转移能力。第三部分:atg4a对胃癌细胞干性及上皮间质转化影响的机制目的:通过筛选atg4a促进胃癌细胞侵袭转移的下游信号通路并进行验证,明确atg4a促进胃癌细胞侵袭转移的分子机制。方法:1,在干扰及过表达atg4a胃癌细胞株中,wb检测自噬标志蛋白lc3的表达变化,以及通过透射电镜观察在干扰及过表达胃癌细胞株中自噬溶酶体的数量变化,明确atg4a是否通过自噬信号途径发挥促进胃癌侵袭转移作用。2,通过查阅atg4a同源分子相关信号通路,并通过靶基因软件进行预测分析,结合可能参与胃癌干性维持及上皮间质转化调控的信号通路,进行atg4a蛋白下游分子的筛选。结果发现,notch信号途径,wnt信号途径,nf-kb途径,smad信号途径可能参与atg4a分子对胃癌上皮间质转化及干性的调控,因此我们通过real-timepcr进行验证,在三个干扰细胞株,一个过表达细胞株以及各自对应的空载体细胞株中,筛选上述四种信号通路标志物的表达差异。通过前部分pcr筛选,notch信号途径标志物hes-1变化最为显著,我们从蛋白水平再次进行验证,继续使用前述五种细胞株,提取细胞总蛋白,进行wb实验。3.为了进一步证实notch信号途径是atg4a分子促进胃癌上皮间质转化及调控干性的下游通路,我们采用加入notch途径抑制剂,阻断其通路,观察上皮间质转化及干性标志物的表达变化。4.为了研究atg4a分子促进胃癌细胞侵袭转移是通过notch信号途径,我们加入notch途径抑制剂,阻断其通路,应用transwell小室侵袭实验模型,验证notch信号途径是atg4a分子发挥作用的信号通路。结果1.干扰和过表达atg4a分子后,胃癌细胞中自噬标志物lc3Ⅰ/lc3Ⅱ的比例没有出现有统计学意义的变化,初步证实,atg4a并不是通过自噬信号途径发挥作用。透射电镜观察发现,在干扰atg4a表达细胞株和过表达atg4a细胞株中,自噬小体数量没有出现统计学意义上的变化,证实了atg4a并不是通过自噬信号途径发挥作用。2.通过查阅文献及相关靶基因数据库,我们初步认为notch信号途径,wnt信号途径,nf-kb途径,smad信号途径可能参与atg4a分子对胃癌上皮间质转化及干性的调控。qt-pcr发现,在所筛选的四个下游通路中,干扰atg4a表达后,atg4a在三个干扰细胞株中分别下降51.2%±5.1%,44.3%±4.7%,48.5%±5.9%,p<0.05。而过表达atg4a后,atg4a表达增加52.3%±3.7%p<0.05。wnt信号途径关键分子wnt-5在三个干扰细胞株中分别下降52.5%±5.3%,47.4%±4.1%,41.6%±4.2%,p<0.05。而过表达atg4a后,wnt-5表达增加13.4%±1.3%;p<0.05。hes-1信号途径关键分子hes-1在三个干扰细胞株中分别下降74.6%±7.5%,62.2%±5.6%,68.5%±6.6%,p<0.05。而过表达atg4a后,hes-1表达增加56.3%±4.6%;nf-kb信号途径关键分子nf-kb在三个干扰细胞株中分别下降23.2%±2.7%,6.1%±0.5%,13.6%±1.4%,p<0.05。而过表达atg4a后,nf-kb表达增加11.6%±1.7%;p<0.05。smad信号途径关键分子smad3在三个干扰细胞株中分别下降17.5%±2.1%,33.1%±3.7%,29.2%±2.4%,p<0.05。而过表达atg4a后,smad3表达增加36.3%±3.1%;p<0.05。由以上结果可以看出,notch信号途径关键分子hes-1变化最为显著,表明notch可能是atg4a促进胃癌细胞上皮间质转化和维持干性的下游分子。wb结果发现,干扰atg4a表达后,三个细胞株中hes-1表达均出现下降,三个细胞株分别下降48.5%±4.4%,37.2%±4.7%,31.3%±2.6%,p<0.05。过表达细胞株表达上升21.3%±1.9%。p<0.05。表明notch是atg4a分子的下游信号通路。3.加入notch信号阻断剂dapt后,atg4a分子对上皮间质转化和干性促进作用下降,与对照组相比atg4a表达下降28.2%±2.2%,hes-1下降57.5%±3.8%,sox-2下降43.6%±4.1%,oct-4下降36.2%±3.1%。p<0.05。表明阻断notch信号途径能够逆转atg4a分子对胃癌细胞上皮间质转化及干性的影响。4.加入dapt阻断notch信号通路后,细胞侵袭能力下降,与对照组相比,侵袭能力下降19.4%±2.1%。p<0.05。表明阻断notch信号途径能够逆转atg4a分子对胃癌细胞侵袭能力的促进作用。结论:1,ATG4A调控胃癌细胞侵袭转移并不依赖于自噬信号途径2,ATG4A通过NOTCH信号通路对胃癌细胞干性,上皮间质转化发挥调控作用,从而促进胃癌细胞侵袭转移。