鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是一种新出现的主要危害鸭的致病性黄病毒,具有传播快、感染性强、发病率高的特点。该病毒不仅能感染各品种鸭,还能感染鸡、鹅和野生鸟类等,给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。天然免疫系统是宿主抵抗病原微生物感染的第一道防线。DDX3X蛋白作为DEAD-box RNA解旋酶家族的重要成员之一,除了能调控RNA代谢等传统功能外,近年来关于其参与宿主天然免疫的研究越来越多。报道显示,DDX3X可以作为病毒核酸的识别受体,与天然免疫信号通路的接头蛋白相互作用,促进I型干扰素(IFN)产生,也可以和免疫信号通路中的重要转录因子互作,调控I-IFN表达,抑制病毒复制。近年来,随着养鸭规模和数量的不断增多,养鸭业在我国迅速发展,但面临疫病防控的巨大压力尤其是近年来鸭新发传染病不断出现,严重危害养鸭业的健康发展。疾病的严重程度与病原的致病性以及其与宿主免疫反应之间的相互作用密切相关,相比于哺乳动物,水禽天然免疫系统的相关研究较少,对于鸭、鹅等水禽天然相关基因的鉴定及其与病毒之间的相互作用研究有待进一步加强。目前为止,尚未见有关鸭DDX3X蛋白的相关报道。因此,本研究首先从樱桃谷鸭的脾脏组织中克隆并鉴定了鸭DDX3X(duDDX3X)基因并对其与DTMUV之间的相互作用进行了初步研究。结果显示,duDDX3X基因组由1959个碱基组成,编码652个氨基酸,duDDX3X具有该家族的典型结构,包括9个基序,基序Q、I、Ia、Ib、II、III、VI、V和VI以及DEAD结构域和HELICc结构域。氨基酸同源性分析显示,duDDX3X的氨基酸序列与鸡的同源性最高,为98.3%。与鹅和人、鼠等哺乳动物的同源性约93%,而与鱼类的同源性最低(80.2%)。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)分析表明,duDDX3X具有广泛的组织表达谱,在健康鸭的心、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑、脑干、胰腺、肌胃、腺胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、法氏囊、胸腺、食管、气管和肌肉中均普遍表达,尤其在盲肠的表达量最高,在回肠、肝、脾、胰腺、直肠和空肠中也强烈表达。但在肾、肺、大脑、小脑和法氏囊等组织的表达量较低。亚细胞定位分析显示,duDDX3X蛋白主要分布在细胞质中。通过qPCR和western blot分析,我们发现在DTMUV感染的鸭胚成纤维细胞(duck embryo fibroblasts,DEF)中,病毒能显著下调duDDX3X的表达,提示duDDX3X可能参与病毒复制。我们在DEF细胞上过表达duDDX3X后24 h感染DTMUV,然后在不同时间点采集细胞样品,检测病毒滴度,发现duDDX3X在感染早期(24 h和36h)能显著抑制病毒复制,进一步通过siRNA实验,发现干扰duDDX3X后DTMUV复制增强,表明duDDX3X蛋白能有效抑制DTMUV复制。为进一步确定duDDX3X抑制病毒复制的作用机制,我们通过双荧光素酶报告基因实验检测了duDDX3X对IFN-β、NF-κB和IRF-7启动子活性的影响,发现duDDX3X能显著促进IFN-β和IRF-7启动子活性,而且将duDDX3X过表达后检测宿主细胞因子也证实duDDX3X蛋白能显著促进I-IFN的表达,但对促炎细胞因子如IL-1β、IL-6和CXCL-8等的表达没有显著影响。将duDDX3X进行过表达或干扰处理,12 h后感染DTMUV,感染后24 h检测IFN-β含量,发现duDDX3X过表达时能显著促进DTMUV刺激的IFN-β表达,而duDDX3X被干扰后DTMUV刺激的IFN-β表达量也下降,提示duDDX3X可能是通过促进I-IFN的表达来抑制DTMUV复制。将duDDX3X和RIG-I共转染细胞,检测其对IFN-β启动子活性影响,结果显示duDDX3X也能促进RIG-I诱导的IFN-β表达,说明duDDX3X蛋白能通过RLR信号通路调控I-IFN表达影响病毒复制。综上所述,本研究率先克隆了鸭DDX3X基因,该基因与鸡的DDX3X同源性最高且具有广泛的组织表达谱。DTMUV与duDDX3X的相互作用研究表明,DTMUV能下调duDDX3X的表达,但duDDX3X能诱导I-IFN表达,并通过促进DTMUV和RIG-I刺激的I-IFN产量抑制病毒复制。研究结果有助于了解DDX3X在鸭天然免疫系统中作用,同时为进一步研究DTMUV与宿主的天然免疫反应奠定基础。