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目的:运用网络药理学分析与动物实验验证关键核心靶点探究舒血宁注射液(Shuxuening injection,SXNI)治疗缺血性脑卒中(Ischemic stroke,IS)的作用机制。方法:一、网络药理学部分:1.通过TCMSP,TCMID,Batman-TCM三种中药数据库查询银杏叶的化学成分,按照DL≥0.18,OB≥30%的筛选条件初步确定银杏叶的活性成分。运用TCMSP数据库、STITCH数据库、CNKI数据库、PubMed数据库查询活性成分对应的靶点,且将结果输入到Uniprot数据库中,得到所有靶点蛋白的基因ID和基因名。活性成分与基因靶点导入到Cytoscape 3.7.1软件中构建“成分-靶点”网络图。2.运用Genecards,OMIM,TTD,Disgenet四种疾病数据库查询IS的基因靶点,将IS的靶点与活性化合物的靶点取交集后得到SXNI治疗IS的潜在作用靶点。3.运用DAVID 6.8数据库对潜在靶点进行GO分析和KEGG通路分析。4.通过Cytoscape软件构建“成分-潜在靶点-通路”网络图,并对潜在靶点与活性化合物进行拓扑分析,通过筛选拓扑指标参数的中位数获取核心靶点和核心化合物。5.采用AutoDock Vina对上述获取的核心靶点和核心化合物进行分子对接。首先,应用Maestro 11.9软件计算蛋白靶点的RMSD值。选取RMSD<2,蛋白分辨率<2.8?且具有配体复合物的蛋白晶体结构;然后将得到的蛋白三维结构与活性化合物进行对接,计算出每个基因靶点与核心化合物对接后affinity值,并将所有基因靶点对接的分数进行汇总,按照affinity的平均分值由低到高进行排序,筛选出affiniy<-7的基因靶点;选取对接平均分数最低的三个靶点作为关键核心靶点,运用Maestro 11.9软件将具体的对接情况以3D图形进行展示,分析关键氨基酸残基间的氢键、Pi-pi键等相互作用。二、动物实验部分:1.建立大鼠MCAO模型,mNSS神经功能缺损评分评价大鼠神经功能损伤程度。2.通过TTC染色计算大鼠梗死体积。3.运用HE染色观察大鼠海马区神经元细胞的形态。4.荧光定量PCR检测3个关键核心靶点的mRNA含量。5.运用Western blotting检测3个关键核心靶点蛋白的表达量。结果:一、网络药理学部分:1.通过查询TCMSP,TCMID,Batman-TCM三种中药数据库以及结合文献查询,通过DL≥0.18,OB≥30%筛选后得到了SXNI有关的17个活性成分,并运用TCMSP和STITCH数据库查询到112个与活性成分有关的靶点,将结果导入到Cytoscape软件构建“成分-靶点”网络图。2.通过查询Genecards,OMIM,TTD,Disgenet数据库,得到了1537个IS相关的靶点,将IS的靶点与SXNI中活性成分的靶点进行重叠后得到52个共有靶点,作为潜在靶点。3.通过GO富集分析,KEGG通路分析,将P<0.05作为筛选标准,共得到27条通路,并选取前10条通路作为核心通路。4.运用Cytoscape软件构建“成分-潜在靶点-通路”网络图,通过对活性化合物和潜在靶点进行拓扑分析,得到了9个核心化合物和28个核心靶点。5.将上述得到的28个核心基因与9个核心化合物运用AutoDock Vina进行对接分析,将每个核心靶点的对接分数汇总,计算平均值。通过筛选affinity(结合亲和力)小于-7的平均值的基因有15个,选取平均值最低的3个核心基因作为关键的核心基因(PTGS2,NOS3,CASP3),然后找到三个基因中每个基因分别对应的affinity分值最低的化合物(山奈酚、木犀草素、懈皮素),运用Maestro 11.9软件将基因靶点与化合物的结合情况以3D图形式展示。二、动物实验部分:1.再灌注后24 h,48 h,72 h分别对大鼠进行mNSS神经功能评分。结果可见,Sham组未见神经功能缺损症状;与Sham组相比,SXNI组与I/R组mNSS评分明显升高(P<0.05);与I/R组相比,SXNI组mNSS评分明显降低(P<0.05),并随治疗时间的延长下降趋势明显增加。2.脑组织TTC染色:结果可见,与I/R组相比,SXNI组大鼠的脑梗死体积明显下降(P<0.05),SXNI通过降低再灌注模型大鼠梗死体积对脑组织起到保护作用。3.大鼠海马区HE染色结果可见,Sham组大鼠海马CA1区神经元细胞正常,未见明显神经元细胞损伤;I/R组脑组织可见多处碎片状坏死,海马周边组织可见较多的炎症细胞浸润及小胶质细胞增生;SXNI组海马区神经元细胞中一部分细胞肿胀破裂,海马区周围组织可见少量炎症细胞浸润。4.通过RT-qPCR实验结果显示SXNI能够使PTGS2和CASP3的mRNA表达量降低(P<0.05),升高NOS3的mRNA表达量(P<0.05)。5.通过Western blot实验结果显示SXNI能够使PTGS2和CASP3的蛋白表达量降低(P<0.05),使NOS3的蛋白表达量升高(P<0.05)。结论:通过网络药理学分析以及动物实验研究发现,SXNI可通过多靶点、多成分、多途径治疗IS,其主要的作用机制与抑制炎症、调节氧化应激水平,降低脑组织神经元细胞的凋亡有关。