第一部分丝素蛋白/磷酸八钙复合物的制备及表征【目的】选用HA前驱体磷酸八钙(OCP)与具有良好成骨性能的丝素蛋白(SF)复合,通过均相沉淀法制备丝素蛋白/磷酸八钙(SF/OCP)复合物材料,研究SF浓度、温度、反应时间与形成的OCP之间的依赖与响应性关系,并研究SF/OCP复合物材料的表面特征。【方法】将桑蚕丝放入含碳酸钠的水溶液中,煮沸,搅拌,再用力搓洗,然后烘箱干燥。在溴化锂溶液中溶解,然后搅拌,透析,然后浓缩,最后离心,取上清液,制备得到SF。配制Na H2PO4及Ca(CH3COO)2溶液,其中含SF的浓度分别为0、0.1%、0.3%、1%、2%和4%,wt/v%。搅拌条件下将溶液加至磷酸二氢钠溶液中,再反应0.5h。将沉淀物离心洗涤,至p H为中性。最后将沉淀物冷冻干燥得到SF/OCP复合物粉色粉末。根据SF在钙溶液中的含量(0%、0.1%、0.3%、1%、2%、4%,wt/v%),分别制得OCP、0.1SF/OCP、0.3SF/OCP、1SF/OCP、2SF/OCP和4SF/OCP六种产物。再通过FTIR、XRD、SEM及TEM观察并测量其表征。【结果】通过FTIR及XRD观察分析,相对于纯OCP或SF,复合物红外光谱图中同时具有OCP和SF的特征吸收谱带,在不同条件下制备的SF/OCP复合物中均表现出OCP特征峰,且特征峰大小随SF含量不同而有所区别。纯OCP在SEM及TEM扫描或透射下,表现为典型的薄的片状晶体形态,在SF存在条件下制备的SF/OCP复合物中,OCP也表现出典型的OCP晶体形态。【结论】通过FTIR、XRD、SEM及TEM观察及检测,实验中成功制备出OCP晶体及SF/OCP复合物,SF的引入能够调控OCP的形成,有利于形成更小尺寸的典型OCP晶体。第二部分丝素蛋白/磷酸八钙复合多孔支架的制备及性能研究【目的】在体外模拟体液中或细胞培养过程中,通过材料组成和溶液物化性质的变化,考察OCP向HA的转化过程中,观察成骨细胞在不同条件下制备的材料上的粘附、生长和增殖情况及体外毒性,以研究材料的细胞相容性问题,并研究SF/OCP多孔支架的孔径和力学等性能与制备条件的关系。【方法】先制备SF/OCP复合物,再分别称取5mg和10mg的SF/OCP复合物,与10%的SF混合均匀,冷冻干燥得到多孔支架。再甲醇及常温处理1小时,后水洗,再次冷冻干燥。按照所含比例的不同,其中含SF/OCP复合物5mg和10mg的多孔支架分别记为SF/OCP-1复合支架和SF/OCP-2复合支架。再通过SEM、TEM及TGA观察SF/OCP复合多孔支架的表征。先制备SF、SF/OCP-1和SF/OCP-2三组样品,浸入去离子水中,观察并记录样品不同时间点的溃散情况、细胞相容性及力学性能。将制备SF、SF/OCP-1和SF/OCP-2三组样品进行细胞的培养,使用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值(OD),记录结果。将MC3T3-E1细胞系植入制备的SF、SF/OCP-1和SF/OCP-2三组样品中,在培养箱中培养2,4,6天,并在不同时间,加入CCK-8试剂,测定测试OD值,以了解细胞相容性。【结果】在SF/OCP复合物中,OCP均表现出典型的OCP晶体形态,即薄的片状晶体形态,并可以清楚的观察到单根OCP晶体的形态,晶体直径大约为100-300nm。通过对SF/OCP复合物的元素分析,进一步验证了SF/OCP复合物中的晶体为OCP。纯SF溶液制备的SF/OCP复合多孔支架,孔径较为均匀,孔径分布在30-100μm。实验中制备SF/OCP-1复合支架,支架孔径均匀性相比SF支架变差,孔径变大,孔径分布在30-200μm。而制备的SF/OCP-2复合支架,孔径比SF支架小,均匀性变差。SF、SF/OCP-1和SF/OCP-2三组样品在浸提液毒性实验中,细胞相对生长率(RGR)均大于100%,细胞毒性分级(CTS)属于0级,证明SF、SF/OCP-1和SF/OCP-2三组样品细胞相容性良好,对细胞生长基本无毒性作用。纯OCP无法成型,极易破碎,因此实验中将其与SF复合改善其力学性能,本实验中将冷冻干燥后的SF/OCP复合支架进一步采用甲醇后处理,经此方法得到的SF/OCP复合支架在水中具有良好的抗溃散性能。【结论】加入不同量的SF/OCP复合物,会影响支架的基本形态和孔径。必要的孔隙率和孔径是细胞在支架内生长的基本条件。SF/OCP多孔支架拥有高度有序多孔多级结构,具有良好的的孔径,较大的比表面积,可拥有良好的生物性能。在细胞相容性及体外细胞毒性实验中,细胞活性不受SF/OCP复合物材料影响,具有细胞相容性好,对细胞生长基本无毒性作用。本实验中得到经甲醇后处理的SF/OCP复合支架,具有良好的抗溃散性能。第三部分丝素蛋白/磷酸八钙复合多孔支架的体内成骨性能研究【目的】针对目前组织工程骨支架材料骨修复能力不理想问题,选用HA前驱体OCP与具有良好成骨性能的SF复合制得多孔支架,以提高骨修复效果。重点研究复合支架中OCP在体内向HA转化,并可调控成骨细胞、破骨细胞在OCP上合成骨基质和降解OCP,从而调控成骨过程。拟通过本研究考察此种材料的成骨机理,为构建活性组织工程骨材料提供理论基础和新思路。【方法】取健康雄性SD大鼠,注射麻醉,在大鼠背部作切口,逐层切开,直至肌肉组织,分别将SF支架和SF/OCP复合支架分别植入左右两侧所形成肌袋内,切口分层缝合,形成肌内埋植。术后4周取标本,大体观察标本后,甲醛固定,脱钙,顺序脱水、石蜡包埋,切片,H&E染色,光镜下观察材料降解情况。取健康SD大鼠,注射麻醉,沿大鼠颅骨矢状轴切口暴露顶骨,以5mm环钻于顶骨左右骨瓣各作一骨缺损,深及全层颅骨,建立颅骨缺损模型。术中分别植入SF支架和SF/OCP复合支架。关闭切口,分笼饲养。术后6周及12周后取材,进行Micro-CT检测,观察缺损区大体标本的骨形成情况。将大鼠处死后取出标本,甲醛固定。将固定的标本用PBS清洗,后用蒸馏水清洗,脱钙一周,标本浸蜡及包埋,切片机切成薄片,烘片,最后进行H&E染色,在光镜下观察。【结果】利用健康SD大鼠进行肌内埋植及建立大鼠颅骨缺损模型,通过Micro-CT、H&E染色实验,结果证明SF/OCP复合多孔支架具有调控成骨细胞在OCP上合成骨基质和降解OCP,从而调控成骨过程,促进骨组织生长功能。【结论】体内植入SF/OCP复合多孔支架,证明多孔支架形态有利于细胞在支架内部生长,加速骨修复过程,在OCP上成骨细胞合成骨基质和降解OCP,从而调控成骨过程。SF/OCP复合支架负载种子细胞具有明显的体内原位及异位成骨能力。