前言氟是一种低剂量时为人体生理代谢所必需但过量摄入可造成人体全身性毒性损伤的微量元素。地方性氟中毒(简称地氟病)是由于人们生活在高氟环境中长期摄入过量的氟而造成的全身慢性中毒性疾病,是一种呈世界性广泛分布的生物地球化学性疾病。全球已有50多个国家和地区报道地方性氟中毒的存在,据WHO估计,全球氟中毒人数可能超过7000万人,而中国接近4000万。目前,全国地氟病病区人口约为1.16亿,病区县除上海市和海南省外,其他各省、区均有分布。地氟病对机体的损害主要可分为骨相损害和非骨相损害,其中尤以骨相损害为重。骨相损害主要表现为氟骨症和氟斑牙。氟骨症是慢性氟中毒最主要也是最严重的临床表现,其病理表现多种多样,其中高骨转换状态,即骨转换加速是其重要特征。氟骨症的骨硬化主要是成骨活动加强而不是破骨活动减弱的结果,氟骨症的各种病理改变的表现都是骨吸收与骨形成正常动态平衡的破坏。骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)是一种高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白,其主要与羟磷灰石结合,介导细胞黏附于骨表面,与羟磷灰石核心形成及骨再建过程有关,在新形成骨及骨再建活跃部位高表达,调控未分化细胞向活性成骨细胞分化,对成骨细胞的趋化、粘附和分化及基质的矿化有重要作用。骨生物学研究已证实BSP是骨转换过程中的一种重要的骨细胞外基质非胶原蛋白。根据其骨分子生物学作用我们推测BSP在氟骨症的发生发展过程中可能发挥一定的作用。但经检索国内外文献,关于亚慢性过量氟暴露时BSP在骨组织中的表达特点迄今尚未见报道,目前仅见徐志灵等进行的过量氟对牙组织发育中BSP分泌的研究。本研究旨在通过观察亚慢性过量氟暴露时BSP在实验大鼠骨组织中的表达特点,为阐明地方性氟中毒的发病机制提供理论依据和新的思路。材料与方法一、动物分组选取购自中国医科大学实验动物部的离乳1周的雄性Wistar大鼠60只,体重(80±10)g,适应性饲养1周后,按体重均衡的原则随机分为4组,每组15只。四个剂量组分别为:对照组(饮自来水)、低氟组(饮水含氟50mg F/L)、中氟组(饮水含氟100mg F/L)和高氟组(饮水含氟150mg F/L),各组大鼠喂饲全营养颗粒大鼠饲料,自由进水及进食。实验周期为3个月,于实验的第1、2和3月末个组分别在采集尿样和血样后处死5只大鼠,采集骨样。二、指标检测(一)大鼠体内氟负荷与日尿氟排泄量测定大鼠体内氟负荷以血清氟和骨氟含量表示。骨氟含量以管式炉高温燃烧水解法-氟离子选择电极法测定。血清氟和尿氟含量以氟离子选择电极法测定。(二)BSP的免疫组织化学染色及显微图像分析将大鼠股骨样品固定5天,脱钙,分切整理,脱水,石蜡包埋,制作5μm石蜡切片,用于HE染色及免疫组化染色。以BSP兔抗大鼠多克隆抗体作为一抗,以生物素化山羊抗兔IgG作为二抗,DAB显色,苏木素复染,常规酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,用于低倍镜下(10×)观察。将免疫组化切片置于OLYMPUS光学显微镜下(40×),将数值化图像输入OLYMPUS多媒体图像分析系统,把阳性表达的强度转化为数字信号,对免疫组化阳性区域的染色强度进行半定量分析。每例随机选取5个高倍视野,测定BSP免疫组化染色平均综合光密度,取每张切片的均值作为该例的测量值。三、统计分析方法采用SPSS12.0软件对实验数据进行方差分析、相关性分析等统计学分析。实验结果一、大鼠一般状况及氟斑牙发生发展情况实验期间,对照组大鼠被毛光滑、有光泽,活动度好。染氟组大鼠被毛失去光泽,活动度较差。不同浓度的染氟组大鼠出现不同程度的氟斑牙表现,且随着染氟时间的延长和染氟剂量的升高,氟斑牙的损伤程度明显加重。二、尿氟、血清氟和骨氟的水平在同一个染氟月份内,三个染氟组大鼠的尿氟、血清氟和骨氟水平明显高于对照组大鼠的尿氟、血清氟和骨氟水平,且尿氟、血清氟和骨氟水平随染氟剂量的增加而升高(P＜0.01)。在同一个染氟浓度下,尿氟、血清氟和骨氟水平随着染氟时间的延长而不断升高(P＜0.01)。三、骨组织的形态观察及BSP免疫组化染色(一)HE染色结果低倍镜下(10×)可见,与对照组比较,染氟组大鼠骨组织结构发生改变。随着染氟时间的延长和染毒剂量的升高,骨细胞的数量随之增多,骨小梁增生、变粗、排列紊乱。(二)BSP免疫组化染色结果高倍镜下(40×)可见,对照组大鼠的骨组织中,BSP表达于骨皮质中的成骨细胞和骨髓腔内的骨髓基质细胞(成骨细胞前体细胞)中。阳性染色是胞浆为棕色着色,而细胞核为蓝色着色;阴性染色则是仅仅细胞核为蓝色着色。与对照组比较,染氟组大鼠骨组织的骨皮质和骨髓腔中骨髓基质细胞中BSP的阳性表达均显著增强。随着染氟时间的延长和染毒剂量的升高,成骨细胞和骨髓基质细胞中BSP的阳性表达明显增强。四、BSP表达水平的半定量分析在同一个染氟月份内,各染氟组的平均综合光密度值均明显高于对照组(P＜0.01),表明各染氟组的BSP表达水平显著增强。在同一个染氟剂量组中,BSP的平均综合光密度值随着染氟时间的延长而不断升高(P＜0.01)。五、BSP表达强度与骨氟含量的相关分析在同一染氟月份中,大鼠骨组织中BSP阳性表达的平均综合光密度与骨氟含量呈明显的正相关关系(染氟大鼠1、2、3月骨组织中BSP表达的平均综合光密度值与骨氟含量的相关系数分别为0.971、0.886和0.940,P＜0.01(双侧))。结论亚慢性过量氟暴露对大鼠骨组织中骨涎蛋白表达水平有影响,各染氟组大鼠BSP的表达水平高于对照组,且BSP的表达水平与骨氟含量间存在着明显的正相关关系。推测BSP可能在慢性氟中毒的病理性骨转换过程中发挥重要的促进作用。