研究目的乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染所致的乙型肝炎是一个世界性的难题,全世界有数亿人口被乙肝病毒所感染,其中每年有数十万病人死于由此引发的相关肝脏疾病。部分乙肝病毒感染者可以通过机体较强的免疫反应将病毒完全清除,但也有部分感染者以及大多数垂直传播所致的感染者,不能及时清除病毒,造成持续的慢性病毒感染。这种慢性感染引起的持续性肝炎不仅使被感染者身心倍受折磨,也是肝癌和肝硬化的重要诱因。因此,深入研究机体抵抗HBV感染的免疫反应机制并筛选潜在的免疫治疗靶点,具有重要的临床意义和社会价值。现有研究指出,乙肝病毒侵入人体后,CD8+T细胞在病毒的清除中发挥着重要的作用。CD8+T细胞能够识别病毒多肽-MHCI类分子复合体,增殖活化并分泌IFN-γ TNF-α等细胞因子,释放颗粒酶、穿孔素等,同时增强FasL的表达,通过这些途径作用于病毒感染细胞,抑制病毒复制或引起病毒感染细胞的凋亡或裂解,最终达到清除病毒的目的。尽管CD8+T细胞在HBV感染过程中的免疫防御功能已经比较清楚,但是关于其在HBV感染的特定疾病环境下细胞行为调控尚待探讨,深入这一领域研究并基于此开发CD8+T细胞功能人为干预技术可能是免疫治疗HBV感染的一个突破口。TIPE2(Tumor necrosis factor-alpha induced protein8like-2, TNFAIP8L2)分子是2008年发现的新型抗炎蛋白,主要表达于各类淋巴组织及免疫细胞的表面。TIPE2分子通过对T细胞表面受体和Toll样受体负调控维持免疫系统稳态,在免疫系统中发挥重要作用。本课题组前期研究证实,TIPE2基因缺陷小鼠更容易诱发HBV所致的肝脏炎症。多数文献报道指出,HBV感染所致的肝脏炎症主要是由病毒特异性的CD8+T细胞对病毒感染细胞的杀伤所致。为此,本课题从小鼠模型和慢性乙肝病人外周血标本两个方面入手,研究TIPE2分子对HBV感染过程中CD8+T细胞功能的调控作用,不仅为进一步研究HBV感染的分子机制提供实验依据和理论基础,并且为乙肝的临床治疗提供研究方向和潜在靶点。材料方法1.TIPE2在HBV感染小鼠模型中的研究1.1HBV致敏小鼠脾淋巴细胞的获取取8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠和相同背景的TIPE2基因敲除小鼠TIPE2腿部肌肉注射HBV表达质粒(100μg/只),两周后加强一次。二次免疫10天后,将小鼠处死,无菌取脾,200目铜网研磨制成单细胞悬液。1.2HBV致敏脾淋巴细胞体外杀伤检测致敏脾细胞悬液与转染HBV质粒的Hepal-6细胞以效靶比50：1共培养,24h后CCK-8法检测细胞活性。1.3HBV致敏脾淋巴细胞的过继转输致敏脾淋巴细胞悬液过继转输到8周龄C57BL/6背景的转HBV全基因组小鼠体内,48h后处死小鼠,取肝脏,HE染色观察肝脏炎症。2.乙型肝炎患者外周血标本检测2.1HBV感染者外周血CD8+T细胞TIPE2分子表达检测取健康对照和HBV感染者外周血,流式抗体胞内标记TIPE2分子,流式细胞仪检测HBV感染者外周血CD8+T细胞TIPE2分子的表达变化,并分析TIPE2分子表达水平与血清ALT、AST、HBV DNA载量之间的相关性,根据结果将乙肝患者分为TIPE2高水平组与低水平组,分析TIPE2表达水平对CD8+T细胞功能的影响。2.2HBV感染者外周血CD8+T细胞活化检测取健康对照和HBV感染者外周血,流式抗体标记T细胞活化标志分子HLA-DR和CD38,流式细胞仪检测阳性细胞的数量变化。2.3HBV感染者外周血CD8+T细胞功能检测取健康对照和HBV感染者外周血,无菌分离PBMC,培养于含10%FBS的RPMI1640培养基,加HBC18-27特异性肽刺激,6h后收取细胞。流式抗体标记胞内分子perforin、Granzyme B和IFN-y,流式仪检测阳性细胞的数目变化。2.4HBV感染者外周血CD8+T细胞凋亡检测分离健康对照和乙肝病毒感染者外周血单个核细胞,Annexin V流式抗体以及抗人CD3、CD8抗体孵育,流式细胞仪检测CD8+T细胞凋亡。2.5HBC18-27短肽对健康人外周血PBMC的TIPE2分子表达的影响抽取健康人外周血于抗凝管,无菌分离PBMC,用含10%human AB serum的RPMI1640培养基调细胞密度至6×105/ml,加终浓度为10μg/ml HBc18-27短肽和终浓度30U/ml hrIL-2,于37℃5%CO2细胞培养箱培养。每三天补加一次hrIL-2(终浓度30U/m1),10天后收集悬浮细胞,提取mRNA反转录出cDNA,实时定量PCR检测TIPE2分子表达变化。2.6HBV感染者PBMC HBC18-27短肽诱导后杀伤能力变化抽取HBV感染者外周血,无菌分离PBMC,用含10%human AB serum的RPMI1640培养基调细胞密度至6×105/ml,加终浓度为10μg/ml HBc18-27短肽和终浓度30U/ml hrIL-2,每三天补加hrIL-2(终浓度30U/ml),37℃5%CO2细胞培养箱培养。10天后收集悬浮细胞,与HepG2.2.15细胞共培养(效靶比50：1),24h后CCK-8法检测细胞活性。实验结果1. TIPE2缺失的HBV致敏脾淋巴细胞杀伤功能增强1.1TIPE2基因缺失的HBV致敏脾淋巴细胞造成更严重的肝脏炎症将野生型小鼠和同背景TIPE2基因缺失小鼠来源的HBV致敏脾淋巴细胞过继转输到HBV转基因小鼠体内,48小时后取肝脏切片HE分析。结果显示,HBV致敏的TIPE2基因缺失的脾淋巴细胞造成更严重的肝细胞的空泡化,杀伤效应明显高于野生对照组。1.2TIPE2基因缺失小鼠的HBV致敏脾淋巴细胞在体外能更有效的杀伤靶细胞以野生型小鼠和同种系TIPE2基因缺失小鼠的HBV致敏脾淋巴细胞为效应细胞,与转染HBV质粒的Hepal-6细胞共培养24小时后检测细胞活性,结果发现TIPE2基因缺失的致敏脾淋巴细胞对靶细胞(Hepal-6细胞)的杀伤活性明显高于野生对照组(WT vs. TIPE2-/-,21.33±3.18%vs.60.33±3.53%; P=0.0038)2.乙肝病毒感染者外周血CD8+T细胞TIPE2表达降低,活化增加2.1乙肝病毒感染者外周血CD8+T细胞TIPE2分子表达降低健康人和乙肝患者外周血经荧光抗体标记,流式细胞术检测。结果显示,乙肝患者外周血CD8+T细胞TIPE2分子表达强度明显低于健康人(健康人外周血CD8+T细胞TIPE2表达强度vs.乙肝患者,31.32±3.57vs.19.19±1.18,P=0.0323),且低血清ALT/AST/HBV-DNA载量组病人外周血CD8+T细胞TIPE2的表达强度明显高于高ALT/AST/HBV-DNA载量组(ALT<47U/L vs. ALT>47U/L,22.33±1.26vs.15.06±1.44,P=0.0126；AST<47U/L vs.AST>47U/L,22.83±0.97vs.16.69±1.44, P=0.0064;HBV-DNA<1000VS.HBV-DNA>1000,21.24±0.89vs.15.45±1.89,P=0.0273).2.2乙肝病毒感染者外周血CD83+T细胞活化比例增加健康人及乙肝患者外周血全血经T细胞活化标记分子荧光抗体染色,流式细胞术检测,结果显示,乙肝患者外周血CD8+T细胞表达活化分子的细胞比例明显高于健康对照(健康人外周血CD8+T细胞活化比例vs.乙肝患者,1.56±0.38%vs.19.18±3.43%,***P<0.001)。2.3乙肝患者外周血CD8+T细胞杀伤功能与TIPE2表达强度呈负相关无菌抽提的健康人及乙肝患者外周血单个核细胞,经HBc18-27合成肽特异性诱导6小时后,经荧光抗体标记并流式检测。结果显示,乙肝病毒感染者外周血中分泌穿孔素、颗粒酶B以及干扰素-γ的CD8+T细胞比例明显高于健康对照(perforin:健康人VS.乙肝患者,10.96±3.29%vs.47.78±9.93%,P=0.0244；granzymB:健康人VS.乙肝患者,12.00±5.73%vs.54.50±11.37,P=0.0206；IFN-γ:健康人vs.乙肝患者,0.60±0.09%vs.4.65±0.40%,P=0.0022),且乙肝患者外周血CD8+T细胞TIPE2高水平组CD8+T细胞分泌穿孔素、颗粒酶和干扰素-γ的细胞比例显著低于TIPE2低水平组(perforin:TIPE2高表达组vs.TIPE2低表达组,33.18±3.65%vs.55.90±7.85%,P=0.039；granzymeB:TIPE2高表达组vs.TIPE2低表达组,31.90±2.89%vs.61.23±7.21％,P=0.0092；IFN-γ: TIPE2高表达组vs.TIPE2低表达组,2.70±0.52%vs.5.25±0.31%,P=0.0245)。2.4乙肝患者外周血CD8+T细胞凋亡增加经AnnexinV细胞凋亡试剂盒染色流式细胞术检测,结果显示,乙肝患者外周血CD8+T细胞凋亡比例较健康对照明显增加(健康人VS.乙肝患者,24.13±4.13%vs.50.61±6.35%,P=0.0081)。3.HBc18-27合成肽体外诱导PBMC TIPE2降低,功能增强3.1健康人PBMC经HBc18-27诱导TIPE2降低无菌抽提的健康人PBMC经RPMI1640+10%AB serum培养,并经终浓度10μg/ml HBc18-27合成肽及30U/ml hrIL-2刺激10天后,实时定量PCR检测TIPE2mRNA水平,结果显示,经HBc18-27合成肽诱导的PBMC TIPE2mRNA水平明显低于对照组(control vs. stimulate with HBc18-27,1±0.04vs.0.667±0.01, P=0.0018)。3.2乙肝患者PBMC经HBc18-27,诱导后体外杀伤活性增强无菌分离的乙肝患者PBMC经RPMI1640+10%AB serum添加10μg/ml HBc18.27合成肽以及30U/ml hrIL-2培养10天后,与HepG2.2.15细胞共培养24h,CCK-8试剂盒检测细胞活性,结果显示,与HBc18-27合成肽诱导的乙肝患者PBMC对靶细胞(HepG2.2.15细胞)的杀伤活性明显高于对照组(control vs. stimulate with HBc18-27,1.00±0.08vs.2.28±0.05,***P<0.001)结论1. TIPE2基因缺失明显增强小鼠HBV致敏脾淋巴细胞在体内外的特异性杀伤活性。2.HBV感染过程中CD8+T细胞TIPE2分子表达的降低能促进CD8+T细胞产生更强的功能,从而发挥更显著的抗病毒作用。3.乙肝病毒感染者外周血CD8+T细胞凋亡细胞比例较健康人明显增多,有两方面的解释：一、机体通过及时的清除活化的细胞,避免免疫反应过于强烈而对机体造成损伤；二、活化CD8+T细胞的凋亡有可能是乙肝病毒在体内不能被及时清除而产生慢性乙型肝炎的原因之一。4.本课题从小鼠模型和人外周血标本检测两个方面来研究TIPE2调节CD8+T细胞在HBV感染中的作用,为研究的进一步深入提供了可靠的实验依据和理论基础,为乙型肝炎临床治疗中分子靶点的寻找提供了参考。创新及意义本实验通过小鼠模型实验,首次证明了TIPE2基因缺失后,HBV致敏脾淋巴细胞在体内外的杀伤功能增强。通过对乙肝病毒感染者和健康人外周血单个核细胞流式检测以及HBc18-27合成肽诱导,首次直接证明了TIPE2分子表达的下调对患者体内CD8+T细胞的功能有明显的促进作用,验证了TIPE2对细胞免疫的调控作用。为进一步研究提供了理论基础和实验依据,为乙肝的免疫治疗靶点的寻找提供了方向。