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松材线虫病,又称为松树萎蔫病,是由病原松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)侵染引起的一种毁灭性病害。松材线虫的生活史复杂,且适应环境的能力较强。GSTs酶是真核生物中一种重要的解毒酶,对松材线虫GST基因全长克隆及功能分析对研究松材线虫致病机理具有重要意义,鉴于此本研究旨在探讨松材线虫在侵染松树过程中表达上调的两个谷胱甘肽巯基转移酶基因BxGST3和BxGST1全长克隆及预测蛋白分析,两个基因在松材线虫中的qPCR定量以及原位杂交定位分析,两个基因RNAi干扰及干扰后松材线虫生理特性变化。主要研究结果如下:1.松材线虫谷胱甘肽巯基转移酶基因BxGST3和BxGST1全长克隆及生物信息学分析通过RACE扩增技术得到两个基因的全长,然后通过蛋白预测,同源性分析以及三级结构的预测比对将这两个基因命名为BxGST3和BxGST1,同源性分析发现BxGST3和BxGST1与广杆线虫属和根结线虫属同源性相似度40%-50%。分析结果显示,松材线虫BxGST3基因cDNA全长为738 bp,从核酸序列推测得到的蛋白质序列共编码207个氨基酸,松材线虫BxGST1基因cDNA全长为702 bp,从核酸序列推测得到的蛋白质序列共编码206个氨基酸。BxGST3预测蛋白理论等电点:6.91;分子量:23.56 kDa,预测分子式:C1082H1660N274O306S5;BxGST1蛋白等电点:7.04;分子量:23.87kDa;预测分子式:C1106H1664N274O305S6。经过一系列蛋白生理生化参数的预测,两个蛋白均属于亲水性蛋白,定位于膜内外表面,都是膜蛋白,BxGST3和BxGST1蛋白磷酸位点较多,证明其更容易接受外界信号的传导。2.松材线虫接种黑松前后虫体谷胱甘肽巯基转移酶基因BxGST3和BxGST1 Real-time PCR定量分析及表达的组织特异性比较对松材线虫中BxGST3和BxGST1基因在与树体互作过程中基因表达量变化做了一个定量PCR分析以及这两个基因在松材线虫中组织表达定位分析。定量PCR分析结果表明,BxGST3和BxGST1基因在与树体互作过程中上调,表达量倍数在24h最高。通过将松材线虫中BxGST3和BxGST1基因片段标记为探针,与表达BxGST3和BxGST1 mRNA的细胞杂交,观察和分析BxGST3和BxGST1 mRNA在组织细胞中表达的位置,以此定位松材线虫解毒或抗氧化相关的组织。松材线虫BxGST3和BxGST1基因原位杂交结果表明:标记颜色呈深褐色的主要在松材线虫的食道腺和生殖腺位置,其他部位(比如肠道)颜色较浅,推测当松材线虫受到外界刺激物影响时,机体中BxGST3和BxGST1基因主要在食道腺和生殖腺部位表达,其中原因猜测可能因为在松材线虫与树体互作过程中,树体产生某些物质来抵抗松材线虫,而松材线虫最早受到影响的应该就是口部和生殖器部位的两个通道,因此在食道腺和生殖腺部位BxGST3和BxGST1蛋白表达很高;而肠道可能是对虫体有害物质随着松材线虫取食少量也进入体内而使两个蛋白表达量上升。3.松材线虫谷胱甘肽巯基转移酶基因BxGST3和BxGST1的RNA干扰研究对松材线虫谷胱甘肽巯基转移酶基因BxGST3和BxGST1进行RNA干扰,干扰结果表明,松材线虫在无菌水和dsGFP浸泡下其形态和在灰葡萄孢上的繁殖能力以及侵染松树的致病能力方面并没有明显差异,而经过dsBxGST3和dsBxGST1干扰液浸泡的松材线虫各方面能力都有明显下降,同时通过荧光定量PCR对干扰后的线虫与无菌水和dsGFP浸泡线虫的基因表达量做了比较,结果也证实干扰结果明显降低BxGST3和BxGST1基因的表达水平,起到了沉默的效果。从干扰后实验结果来看,经过dsBxGST3和dsBxGST1干扰液浸泡的松材线虫形态上并没有明显变化,说明干扰这两个基因对松材线虫的形态并没有太大影响,而干扰后的线虫在繁殖能力和取食能力上明显下降,说明沉默两个基因对松材线虫的繁殖取食能力有很大影响。干扰松材线虫BxGST3和BxGST1基因后,对松材线虫的致病力也产生了很大影响,在前期致病过程中,干扰两个基因的线虫明显比无菌水和dsGFP浸泡线虫的致病力下降很多。15d后经过dsBxGST3和dsBxGST1干扰液浸泡的松材线虫所接种的黑松还未有明显发病迹象,而对照组的两个处理的黑松针叶已经明显病变脱绿发黄;32d后dsBxGST3和dsBxGST1干扰液处理的松树出现大量脱绿发黄的针叶,但并未枯黄萎蔫,而对照组已经完全枯黄萎蔫。通过实验结果推测当两个基因被干扰沉默后,松材线虫的解毒应激能力下降,繁殖取食能力也有所下降,从而使松材线虫的致病力下降。