Alzheimer病AB_3-10和CpG基因表达质粒的构建和表达鉴定目的随着人口的老龄化发展，老年性痴呆的代表性疾病——Alzheimer病越来越受到人们的注目。它的发病率在老年性痴呆中占第一位，世界上65岁以上人群中患病率在5～10％。据调查，我国60岁以上老年人已达1.29亿，该人群痴呆的患病率为0.5～5.6％，在全部痴呆患者中阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）占50％。因此探讨阿尔茨海默病的发病机制、诊断以及防治具有重要的意义。AD是好发于中老年人的一种神经系统退行性疾病，其临床症状主要表现为认知行为能力下降和行为异常，显著的病理学特征是脑内出现神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles）和B—淀粉样蛋白（B—amyloid protein，AB）沉积形成老年斑（老年斑是老年性痴呆特征性病理改变，B—淀粉样是其主要成分），已有研究发现B—淀粉样蛋白沉积、聚集形成老年斑是AD病理的中心环节，对AD的治疗热点在于脑内AB斑块的清除。尽管象AD等神经退行性疾病不被认为是经典的炎症或者免疫系统介导的疾病，但在一定程度上免疫系统对这一退变过程起重要作用。将AB作为疫苗对动物进行免疫，有明显抑制转基因小鼠脑内AB的沉积，清除原有斑块的作用，从而减少异常AB沉积对认知功能的损害。1999年Schenk等人首次用AB_1-42免疫治疗AD转基因动物模型，结果显示免疫不仅产生了特异性的AB_1-42抗体，阻止和减少了淀粉样斑块的形成，而且提高鼠的认知能力，但在临床Ⅱ期实验中，出现了副作用，约有5％的AD病人疫苗接种后出现了脑膜脑炎，实验被迫停止。在尸检中发现患者的脑膜中有T细胞和巨噬细胞的浸润。因此如何降低疫苗接种时T细胞的反应性，是减少其副作用的有效手段。研究者目前将目光转向小分子的AB的N末端抗原表位的应用，认为以此免疫动物能有效地清除斑块，并能避免炎症反应。基于这些考虑构建AB亚单位疫苗，这些疫苗在设计上减少了T细胞的抗原决定簇，保留了B细胞抗原决定簇，避免AB的毒性片断。AD的免疫治疗引起了世人的关注，尽管它遭受了挫折，但经过研究者的不懈努力，AD免疫治疗重现希望之光。疫苗没有引起针对动物自身抗原的免疫反应，对中枢神经系统的正常功能也没有明显的损害。近年来研究发现，普遍存在于细菌DNA中非甲基化的CpG基序有强烈的免疫刺激效应。CpG ODN是指含有胞嘧啶—磷酸—鸟嘌呤基序（CpG DNA）的寡脱氧核苷酸。人工合成的含CpG基序的寡核苷酸（CpG ODN）能够模拟细菌DNA中CpG基序的免疫刺激特性，并且能诱导Th1型为主的免疫应答。CpG ODN与蛋白类抗原联合应用可以有效地诱导机体产生免疫应答，具有潜在的免疫佐剂效应。鉴于目前基因疫苗的一个普遍的缺点是其免疫原性较弱，为了提高重组体的免疫原性，我们在实验中同时应用免疫佐剂CpG DNA，以提高重组体对动物的免疫效果。为寻找更安全、有效、廉价的治疗方案，我们构建Alzheimer病AB_3-10和CpG基因表达质粒，探讨其作为Alzheimer病特异性疫苗的可能性，为进一步研究AB主动免疫清除老年斑的作用机理和DNA疫苗的研制奠定了基础。方法在GenBank中查到AB_3-10的cDNA序列，人工基因合成AB_3-10基因片段和AB_3-10-CpG基因片段（上游含有HindⅢ酶切位点，下游含有EcoRI酶切位点），以限制性内切酶HindⅢ和EcoRI双酶切，将AB_3-10和AB_3-10-CpG目的基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+），构建pcDNA3.1（+）-AB_3-10和pcDNA3.1（+）-AB_3-10-CpG真核表达载体，转化感受态菌DH5α，提取质粒，以pcDNA3.1（+）通用引物进行PCR，挑取阳性克隆，酶切鉴定重组子，然后测序验证，与NCBI BLAST对比目的基因相符，载体构建成功。小量抽提质粒，脂质体试剂Lipofectamine 2000体外转染Cos-7细胞系，用Western—blot方法鉴pcDNA3.1（+）-AB_3-10和pcDNA3.1（+）-AB_3-10-CpG能在该细胞中表达。结果构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-AB_3-10及pcDNA3.1（+）-AB_3-10-CpG，经测序验证。经NCBI BLAST软件比对，与目的片段无误。并且在转化此质粒的Cos-7细胞系中测出了AB_3-10和AB_3-10-CpG的表达。结论成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1（+）-AB_3-10和pcDNA3.1（+）-AB_3-10-CpG并能在真核细胞中进行表达，可以将其作为Alzheimer病特异的候选疫苗，为下一步基因疫苗转基因动物体内免疫学试验提供了依据，同时为进一步研究AB主动免疫清除老年斑的作用机理和DNA疫苗的研制奠定了基础。