泛素化是真核生物体内一种普遍存在的蛋白质翻译后修饰形式,参与调控蛋白降解、信号转导、DNA损伤修饰等许多重要的生命活动过程,泛素修饰系统的紊乱与癌症、神经退行性疾病等许多重大疾病密切相关。深入研究蛋白质泛素化参与细胞功能调控的生物化学、生物物理学机制,对于人类生命奥秘的揭示、疾病的诊断及治疗都具有重大意义,而实现这一目标的一个重要需求便是获取结构、性质均一的泛素化蛋白样品及功能化泛素探针工具。蛋白质化学合成允许我们在原子水平精准地构筑目标蛋白,为获取各种泛素化蛋白及泛素工具分子提供了强大的技术平台,并且在揭秘泛素信号的研究过程中发挥着不可替代的关键性作用。本论文围绕泛素化蛋白的合成新技术开展了相关研究工作,希望借助功能化小分子连接臂协助的蛋白偶联反应,以重组表达的蛋白为原料,获取泛素修饰蛋白模拟物。在这里,我们结合了“半胱氨酸-胺乙基化反应“及“自然化学连接反应”,建立了半合成泛素修饰蛋白的新方法。具体工作如下:我们首先以泛素化组蛋白为合成目标,发展了一种半胱氨酸-氨乙基化反应协助的泛素化蛋白半合成新策略-CAACU策略。该策略的关键是通过半胱氨酸-氨乙基化反应将携带可移除辅基的β-氨基卤代物装载至组蛋白的特定位点,随后经辅基介导的自然连接反应实现泛素与组蛋白的连接。由于泛素及组蛋白单元均可通过重组表达简易获取,运用新策略我们可以高效便捷地获取多毫克级别的单泛素、二泛素以及SUMO修饰组蛋白,并且所构建的碳-硫类异肽键与天然结构相比仅相差一个原子,具有良好的化学稳定性。新方法合成的泛素化组蛋白可成功组装至核小体并能够被效应蛋白选择性识别,碳-硫类异肽键也可被去泛素化酶有效识别并水解,同时,含有H2BKc34Ub的重组核小体的冷冻电镜结构表明,新策略能够为泛素化核小体的结构机制研究提供可靠的样品合成路径。在建立了 CAACU策略后,我们进一步将其应用于不同连接类型非经典泛素链的高效合成,包括二泛素、同质三泛素、分叉三泛素以及SUMO修饰泛素。通过Kc27-diUb的晶体结构解析,不仅证明了新策略合成蛋白样品具有很高的纯度,并且验证了构建的碳硫类异肽键对真实异肽键的结构扰动较小。此外,我们还发展了一种新型不可降解型二泛素炔烃探针,通过生化实验,验证了该探针可用于去泛素化酶识别非经典泛素链的水解机制研究。因此,CAACU策略可以为非经典泛素链的结构及生化研究提供有效的工具分子。另外,我们以二溴丙酮为铰链试剂,发展了一锅高效制备双硫代丙酮连接的泛素化组蛋白的新方法。泛素突变体UbG76C在优化的酸性硼酸溶液中经二溴丙酮激活后,不经色谱分离即可实现与组蛋白的高效偶联,极大地提高了传统方案的偶联效率。该策略无需复杂的化学转化以及特殊的实验装备,可以简便地在生物实验室实施。此外,结合双标签串联亲和纯化策略,新方案有望应用于在非变性的温和条件下实现泛素修饰蛋白的制备。