目的:通过培养HK-2细胞株,观察和络泄浊方对细胞miR-200a、miR-29c表达的影响,探讨和络泄浊方在治疗肾间质纤维化方面的应用。方法:1.选30只雄性SPF级3月龄大鼠用于和肾络大鼠含药血清的提取。30只大鼠随机分为两组:正常大鼠血清组和和肾络大鼠含药血清组。成人和肾络颗粒用量为30g/d,按“实验动物与人按体表面积等效量换算比率”可算出大鼠的等效剂量。大鼠为人体剂量的10倍,约为和肾络颗粒27g/d/kg。正常大鼠血清组大鼠每日给予等量的生理盐水灌胃。灌胃第7天下午给药后90min,各大鼠腹主动脉取血10ml。离心取上清液,56℃水浴30min灭活补体,0.22um,滤器过滤除菌,-80℃冰箱保存。2.HK-2细胞的培养和处理HK-2细胞在以5%胎牛血清的DMEM/F12培养液,置37℃,5%CO2孵育箱内培养。实验时,将细胞按适当浓度接种于6孔板中,待细胞约70%-80%融合时,换成无血清DMEM/F12培养液培养24h,使细胞同步化。3.实验分组、EMT诱导和后续培养TGF-β1诱导HK-2细胞EMT形成间充质细胞。实验分为4组,分别为:正常细胞组、TGF-β1组(浓度为10ng/ml)、TGF-β1+5%正常大鼠血清组、TGF-β1+5%含药血清组,后续培养48h。4.倒置相差显微镜观察细胞形态学变化将HK-2细胞以105/ml接种于预置无菌盖玻片的6空板中培养至70%-80%融合时,换成无血清DMEM/F12培养液培养24h,使细胞同步化。按照上述分组方案,加入相应药物,置37℃,5%CO2孵育箱内培养48h后,采用倒置相差显微镜观察EMT过程中各组细胞形态学变化,并拍照。5.Western Blot检测α-SMA、E-cadherin等的变化。6.miR-200a、miR-29c表达的检测根据Takara公司逆转录系统试剂盒说明合成第一条cDNA链,以cDNA为模板,U6小核RNA作为内参,进行SYBR Green定量PCR扩增。每份RNA样品均进行3次重复测验,采用2-△△Ct法计算相对表达量。7.分析miR-200a、miR-29c表达的改变,说明和络泄浊方对肾间质纤维化的影响机制。结果:经TGF-β1诱导36h后(B组),HK-2细胞内α-SMA的表达较对照组(A组)显著增加(P<0.05),E-cadherin的表达显著减少(P<0.01),miR-200a、miR-29c的表达较对照组(A组)均显著减少(P<0.05);经5%普通大鼠血清后续培养48h后(C组),可见α-SMA、E-cadherin及miR-200a、miR-29c的表达改变无统计学意义(P>0.05);而经5%大鼠含药血清后续培养48h后(D组),可见α-SMA表达较B组显著减少(P<0.05),E-cadherin的表达显著增加(P<0.05),miR-200a、miR-29c表达较B组均有显著升高(P<0.05)。结论:和络泄浊方可以增加HK-2细胞中miR-200a和miR-29c的表达量,延缓肾间质纤维化过程。