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传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)是严重危害养鸡业的重要病原之一。IBV是一种冠状病毒,在复制过程中易发生突变,因而产生了许多抗原性及致病性有差异的变异株。由于IBV血清型众多,使得IBV的血清学诊断尤为困难。本研究以原核表达的IBV囊膜(M)蛋白的保守区肽段为免疫原,成功制备了针对M蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体,并最终建立了检测IBV的双抗体夹心ELISA方法,为IBV的临床诊断提供了简便、可靠的选择。1.IBVM蛋白的原核表达使用Protean软件对IBVCK/CH/JS/06Ⅱ毒株的M蛋白氨基酸序列进行分析,选取抗原性较好且在不同血清型毒株中相对保守的第158-223位氨基酸,设计相应引物,提取IBV总RNA,采用RT-PCR扩增IBV M基因。将M基因分别克隆至带有His标签的pET-32a(+)和带有GST标签的pGEX-6p-1表达载体,构建重组表达质粒pET-32a-M和pGEX-6p-1-M。将两个重组质粒分别转入表达菌株BL21(DE3)和BL21中,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE显示重组蛋白M-HIS和M-GST的大小分别为28 kD和33 kD,与预期相符。Western-blot鉴定结果显示,重组蛋白M-HIS和M-GST均能与IBV阳性血清特异性反应,说明两种重组蛋白均具有良好的免疫原性。2.IBVM蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体的制备以M-HIS重组蛋白免疫成年兔,200 μg/只,背部皮下多点注射,三次免疫后,耳缘静脉采血,制备血清。经间接ELISA方法检测,免疫兔的血清抗体效价达到了 1:102400。以M-HIS和M-GST重组蛋白分别作为免疫原和检测原,采用杂交瘤细胞技术,最终获得5株稳定分泌M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1B2、1D4、3E5、10G3、10D7。经间接ELISA检测,5株杂交瘤细胞在20代以内均能稳定分泌抗体;通过体内诱生法制备的腹水抗体效价均达到1:105;Westem-blot鉴定结果表明,5株单克隆抗体均能与QX型IBV M蛋白特异性结合;其中1B2反应谱最广,除QX型外,还能够与TW-1型、TC07-2型、Mass型和793/B型等其他四种常见血清型的IBV毒株反应。3.检测IBV的双抗体夹心ELISA方法的建立以多克隆抗体和单克隆抗体1B2分别作为捕获抗体和检测抗体,以M-His作为抗原,建立了双抗体夹心ELISA方法。试验反应条件优化为:捕获抗体最佳包被浓度为4 μg/mL,4℃包被过夜;检测抗体最佳工作浓度为2μg/mL;3%BSA封闭液37℃封闭60min;待检抗原37℃C孵育60min;HRP标记羊抗鼠IgG稀释度为1:10000,37℃C孵育60min;最佳底物反应时间为15 min。该方法建立的双对数回归拟合线线性相关系数大于0.99,通过回归方程确定定量分析M蛋白的检测范围50ng/ml～1.8μg/ml。批间、批内重复实验结果显示变异系数均小于10%,表明建立的方法具有良好的重复性。