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溃疡性结肠炎大鼠中SLC所致淋巴细胞异常归巢的机制背景及目的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是胃肠道最严重的疾病之一,其发病机制一般认为涉及到遗传、免疫、感染等多方面的因素。其中免疫因素在发病中的作用已经得到肯定,目前并不清楚这种过度亢进的免疫反应是特异的抗原持续刺激抑或免疫调节异常所致,但UC的免疫异常发病机制中都有淋巴细胞异常归巢这一相同的病理特性。淋巴细胞异常归巢是UC发生过程中免疫紊乱的主要表现之一,也是发生肠黏膜损伤的主要原因。次级淋巴趋化因子(secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC)是近年来发现的新的趋化因子之一,是目前认为第一参与体内淋巴细胞归巢的趋化因子,但是SLC在溃疡性结肠炎肠道淋巴细胞异常归巢时作用途径和作用通道究竟如何,国内外尚未见报道。为此,本次实验首先拟以不同浓度2.4-二硝基氯苯丙酮液(2,4-dinitrochlorobenzene,DNCB)灌肠液建立大鼠UC模型,探索最佳造模液浓度。建立理想的大鼠UC模型后,了解典型大鼠UC模型中淋巴细胞异常归巢现象,SLC及相关黏附分子表达量的变化,阐明淋巴细胞异常归巢与UC炎症反应的关系;应用SLC抗体干预UC动物模型,观测淋巴细胞归巢及UC炎症的发病情况,来明确SLC在UC发病中作用,进一步通过体外淋巴细胞培养,了解SLC对淋巴细胞归巢的作用机制及途径。方法1.造模方法:将80只SD大鼠随机分为对照组、大、中、小剂量模型组,致敏后分别予以丙酮、20%、10%、6%DNCB灌肠液灌肠造模,观察造模后大鼠的生存状况;结肠病理变化;结肠粘膜损伤指数评分;ELISA法检测结肠组织中细胞因子(IL-2、IFN-γ、IL-6)。2.体内实验:将60只SD大鼠分为对照组、模型组及SLC干预组(干预组)各20只,干预组大鼠在灌肠造模时开始每日自鼠尾静脉注入SLC抗体(15μg/ml/kg)×5day,切片观测各组大鼠肠粘膜下perye淋巴结大小及肠粘膜炎症的变化(HE染色病理切片、细胞因子IL-2、IL-6等);RT-PCR及westen-blot法检测肠黏膜SLC及相关黏附分子α4β7表达量的变化;免疫组织化学法定位检测SLC。3.体外实验:抽取模型组及对照组门静脉血,分离淋巴细胞并培养,利用BOYDEN小室作SLC对淋巴细胞的趋化实验;流式细胞仪检测淋巴细胞表面的黏附分子α4、β7的表达变化;westen—blot法检测模型组及对照组淋巴细胞胞浆、胞核中核因子NF-κB-p65的表达情况。结果:1.造模情况:形态学观察和病理切片观察造模大鼠病变肠粘膜与人肠炎症性病变相似,大、中、小剂量DNCB均能成功造模,大、中剂量DNCB造模成功后,症状持续时间较长,但动物全身反应重、死亡率高,小剂量组局部症状典型,类似UC,死亡率低,但症状持续时间相对较短;造模后第5d(D5)、第14d(D14)、第28d(D28)检测小剂量组、中剂量组及大剂量组的结肠组织中的细胞因子IL-2结果分别为:D5 230±52 280±42 290±39;D14 210±36 270±45280±43;D28 140±28 185±38 190±32(单位:pg/ml);小剂量组与中、大剂量组相比有统计学差异,组织细胞因子IFN-γ、IL-6亦有相似变化。2.体内实验:模型组、干预组大鼠均有异常淋巴细胞归巢现象,peyer’s淋巴结增生,切片perye淋巴结截面积定量比较显示:模型组、干预组与对照组相比,[9.56±0.32;5.84±0.62 vs 1.48±0.58,p＜0.01];模型组与干预组相比,[9.56±0.32 vs 5.84±0.62,p＜0.05]其间均有明显差异;模型组结肠SLC mRNA的表达量与对照组相比明显升高,(0.846±0.07 vs 0.312±0.12,p＜0.01),干预组中SLCmRNA也明显高表达,与对照组相比有统计学差异(0.768±0.135 vs0.312±0.12,p＜0.01)但模型组与干预组之间差别无显著性(0.846±0.047 vs0.768±0.135,p＞0.05);模型组、干预组大鼠结肠SLC蛋白的表达量与对照组相比明显升高,(0.937±0.143,0.804±0.215 vs 0.532±0.201,p＜0.01);但模型组与干预组相比(0.937±0.143 vs 0.804±0.215,p＞0.05)模型组与干预组之间差别无显著性。SLC定位显示表达于粘膜下高内皮微静脉内皮细胞的表面,与正常组相比,模型组、干预组SLC的内皮细胞着色阳性数有差异,p＜0.01。比较淋巴细胞归巢相关黏附分子α4、β7的变化,模型组与干预组之间无差异(0.772±0.108 vs0.725±0.013~◆p＞0.05),但它们与正常组之间差别有高度统计学意义(0.772±0.108;0.725±0.013vs0.418±0.025~*p＜0.01);UC模型大鼠炎症粘膜中IL-2和IL-6的浓度与SLC抗体干预组比较,差异显著[(353.6±25.7)pg/ml vs(133.1±31.2)pg/ml,p＜0.05];[(441.6±22.5)pg/ml vs(145.8±28.9)pg/ml,p＜0.01]。3.体外实验:SLC趋化刺激可提高淋巴细胞的移行反应增高3.7倍,SLC的中和抗体可逆转SLC的这种性能(54.4%),SLC可诱导淋巴细胞的移行反应,并呈现剂量效应关系,但存在饱和现象;模型组中淋巴细胞表面的黏附分子α4(64.58±9.73 vs 16.62±7.84,p＜0.01);β7(56.76±16.13 vs12.93±6.53,p＜0.01)表达量明显升高,模型组、对照组的胞浆NF-κB-p65westen-blot表达结果显示:模型组、对照组都表现为较强表达,模型组表达更高(0.84±0.04 vs 0.75±0.11,p＞0.05)。胞核NF-κB-p65 westen-blot表达结果显示:模型组为强表达,对照组弱表达(0.94±0.34 vs 0.41±0.02,p＜0.05),有显著性差异,模型组的NF-κB-p65活性系数明显高于对照组(1.19±0.43 vs 0.60±0.56,p＜0.01)。结论:1.DNCB造模为免疫迟发过敏反应的模型,可有较重全身反应,6%DNCB丙酮灌肠液可作为最佳浓度对致敏大鼠造模,死亡率低,局部症状典型,类似UC发病,有可一次成批造模,人工可控,模型时间长等优点2.UC病变时存在肠粘膜下淋巴细胞异常归巢现象,炎症肠组织中SLC、黏附分子α4β7表达量明显升高,SLC主要表达于粘膜下层的微血管区,SLC抗体干预后炎症病变减轻。3.SLC对淋巴细胞有较强的趋化作用,黏附分子α4β7是淋巴细胞的归巢受体,淋巴细胞激活后胞内NF-κB被激活,进而促进有关基因的转录,调节炎症递质、细胞因子、黏附分子的产量,导致UC炎症粘膜的损伤。