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背景与目的:脊髓性肌萎缩症（Spinal muscular atrophy,SMA）是一种特征性累及脊髓前角运动神经元引起进行性肌无力和肌萎缩的常染色体隐性遗传病,是婴幼儿期最常见致死性神经遗传病。SMA的致病基因为运动神经元生存（survival motor neuron,SMN）基因1,编码的全长SMN蛋白参与前体信使RNA（pre-m RNA）的剪接、轴突生长和协同Bcl-2蛋白家族抗凋亡等多种重要功能。人类基因组中存在高度同源的SMN1基因和SMN2基因,而7号外显子一个关键的碱基差异c.840C>T使得两个基因的pre-m RNA可变剪接不同,导致SMN2基因主要产生7号外显子缺失的SMNΔ7蛋白。绝大多数SMA患者为SMN1基因7、8号外显子的纯合缺失,而高度同源的SMN2基因因不能产生足量的全长SMN蛋白,不足以弥补SMN1基因功能缺失。因此提高全长SMN蛋白的表达是治疗本病的主要策略,SMN2基因是治疗SMA的潜在靶点。SMA的反义寡核苷酸治疗药物,诺西那生钠,需多次反复的鞘内注射且药物价格昂贵,因此亟需探索新的治疗手段。第三代CRISPR/Cas9基因编辑技术在哺乳动物细胞中的成功应用,为SMA的基因治疗研究带来了曙光。经典的CRISPR/Cas9系统具有2个酶切活性结构域——Ruv C酶切活性和HNH酶切活性,两个酶切活性结构域能分别切割DNA双链,形成DNA双链断裂（Double strand breaks,DSBs）;将Cas9蛋白的第10个氨基酸天冬氨酸突变为丙氨酸（D10A）,使蛋白的Ruv C酶切活性结构域失活（即Cas9 nicked,Cas9n）,仅存的HNH酶切活性切割与单向导RNA（single guide RNA,sg RNA）互补配的DNA单链,产生DNA单链切口;通过Cas9n核酸酶融合表达腺苷脱氨酶实现腺嘌呤（A）到鸟嘌呤（G）的转换,该编辑系统命名为腺嘌呤单碱基编辑系统（Adenine Base Editor,ABE）。ABE编辑系统在sg RNA引导下,仅切割DNA单链并利用腺苷脱氨酶实现A碱基到G碱基的替换,广受人类单核苷酸突变疾病基因治疗研究的青睐。团队前期建立了SMA患者来源的多能诱导干细胞（induced Pluripotent Stem Cells,i PSCs）培养及定向分化获得运动神经元的体系,同时具有smn-/-,SMN22TG/0和SMA-Δ7两种小鼠模型。本研究利用SMN2 minigene的定向突变（A-G）快速筛选能提高SMN2基因7号外显子纳入剪接的有效位点;并利用ABE编辑系统在HEK293T细胞,SMA-I型小鼠来源的胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell,m ESC）和SMA-I型患者来源的i PSC模型上筛选内源性有效编辑位点及确定腺嘌呤碱基编辑工具;在SMA-i PSC和修复后的（Splicing Corrected）SC-SMA-i PSC中验证SMN-FL转录本水平、SMN蛋白表达量、运动神经元分化、SMN蛋白抗凋亡能力和SMN蛋白参与体外sn RNP组装能力的改善情况;并初步建立SMA及SC-SMA分化来源的脊髓前角类器官。方法:1.构建pSMN1,pSMN2及pSMN2-minigene-Mut定向突变（A to G）质粒,在HEK293T中过表达,RT-PCR和q PCR检测定向突变对纳入7号外显子剪接的SMN-FL m RNA水平的提高情况。2.针对SMN2的外显子剪接沉默子设计sg RNA,构建并比较ABE、ABEmax F148A、mini ABEmax及mini ABEmaxV82G系统在HEK293T细胞、SMA-I-m ESC和SMA-i PSC中不同编辑器、不同编辑位点的编辑效率及编辑后氨基酸变化情况,最终确定编辑位点及编辑工具。3.采用mini ABEmax联合sg RNA6编辑SMA-i PSC细胞获得SC-SMA-i PSC单克隆细胞株,从SMN-FL转录本、SMN蛋白表达量、定向分化运动神经元以及SMN蛋白抗凋亡能力等方面评估编辑后SMN蛋白功能改善情况;验证mini ABEmax对有丝分裂后的运动神经元前体及SMA-Δ7小鼠皮层神经元编辑的有效性。4.为确保编辑后不改变SMN蛋白氨基酸序列,进一步在SMN2基因3’UTR区域筛选有效编辑位点,并在修复后的SC-SMA单克隆细胞株中验证SMN-FL转录本水平、SMN蛋白表达量及SMN蛋白参与体外sn RNP组装能力的改善,并初步建立SMA及SC-SMA分化来源的脊髓前角类器官模型。结果:1.在pSMN2-minigene-Mut定向突变筛选中获得Exon7上13个能明显提高SMN27号外显子纳入剪接的位点,在3’splicing site of E8上有一个有效编辑位点。2.针对SMN2的外显子剪接沉默子,4种腺嘌呤单碱基编辑工具在3种细胞类型对内源性SMN2编辑后,综合考虑编辑效率、编辑位点是否改变氨基酸序列及RNA脱靶等因素,最终确定mini ABEmax联合sg RNA6开展后续实验。3.采用mini ABEmax-sg RNA6获得SC-SMAA36G A38G和SC-SMAA36G单克隆细胞株,修复后的单克隆细胞株的SMN-FL m RNA水平、SMN蛋白表达量、SMN蛋白抗凋亡能力均较SMA本身显著提高,与WT基本持平甚至超过。mini ABEmax联合sg RNA6在体外分化的有丝分裂后的SMA运动神经元前体细胞和SMA-Δ7小鼠皮层神经元均能有效编辑。4.在SMN2基因的3’UTR区域获得一个有效编辑位点,并采用mini ABEmax-sg RNA35获得了SC-SMA-E8A-10G单克隆细胞株;该sg RNA编辑完全不影响SMN蛋白的氨基酸序列,且SMN-FL m RNA水平、SMN蛋白表达量均高于SMA本身,与WT水平基本持平甚至超过;修复后的SC-SMA体外sn RNP组装能力与WT基本一致;采用新的方案分化获得了SMA及SC-SMA来源的脊髓前角类器官模型。结论:优化版本的腺嘌呤单碱基编辑系统（mini ABEmax）在内源性SMN2基因中,通过单个或多个碱基编辑Exon7-ESSB和3’splicing site of Exon8获得多株SMA-I型剪接修复的i PS细胞株,且均能提高SMN2基因7号外显子的纳入剪接,使得SMN-FL转录本和SMN蛋白的表达量增高,通过体外分化运动神经元抗凋亡实验和体外sn RNP组装实验证实表达增高的SMN蛋白能发挥正常功能,初步建立脊髓前角类器官模型。综合多方面因素比较,以E8A-10G位点为最优选,可作为后续小鼠成体实验的治疗靶点。