葡萄白粉病侵染过程和葡萄蛋白质双向电泳体系的建立

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本试验以抗白粉病的中国野生葡萄品种白河-35-1、感白粉病的欧洲葡萄品种佳利酿及其二者的F1抗病株系6-12-4和感病系6-12-2为材料,通过考马斯亮蓝R-250染色和解剖观察统计叶片的自然带菌率,比较了田间人工接种白粉菌0 d,1 d,3 d,5 d和7 d后病原菌在叶片表面的生长和侵染过程,以探明葡萄白粉病侵染过程中病原与植物互作的关键时期。并利用白粉菌诱导后6-12-2为材料,比较了3种蛋白质提取方法,建立适用于葡萄叶片总蛋白质提取和双向电泳的最佳体系。田间自然条件下和田间人工套袋隔离2 w后,葡萄抗、感白粉病植株的新稍叶片均存在自然带菌现象,但抗病植株带菌率较低。人工压片接种后,菌丝和分生孢子成功附着在感病和抗病植株的叶片表面。随着接种后时间的增加,不同抗病性葡萄叶片表面白粉菌的数量均缓慢增加;接种3 d后感病植株叶片表面的菌丝数量快速增加,并表现出白粉症状;但抗病葡萄植株表面的菌丝数量增加仍然较慢,不表现白粉症状;对感病材料病斑部位进行显微观察发现,葡萄白粉病的侵染过程为:分生孢子萌发形成芽管,然后在芽管顶端萌发形成附着胞,附着胞下方长出侵染丝并侵入叶片,完成侵染过程。葡萄白粉病原与寄主识别反应的关键时期在接种后3 d内;白粉病人工接种前保持至少2 w的隔离是必要的。在三种蛋白提取方法中, Tri-reagent法提取葡萄叶片蛋白质的产率为3.3606mg/g·FW,木本植物改良法提取的产率为6.8526 mg/g·FW,改良丙酮-三氯乙酸法提取蛋白质的产率为14.8493 mg/g·FW。改良后的丙酮-三氯乙酸法的提取率最高,同时电泳图谱可以分辨出葡萄叶片蛋白质斑点数857个,主要分布在pH4~pH8的范围内。综合分析凝胶的蛋白质斑点信息,改良后的丙酮-三氯乙酸法为最佳提取方法。优化后的双向电泳体系为:IPG胶条在室温下主动水化1 h。17℃条件下,采取250 V、500 V和1 000 V三个除盐梯度进行除盐,然后进行等电聚焦。在15 mA/gel的电流强度下进行SDS-PAGE电泳,结束后采用(NH4)2SO4与H3PO4溶解考马斯亮蓝G-250的染色法染色1 w。
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