甘草药渣发酵预处理、总黄酮提取及生物活性研究

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甘草广泛分布于新疆、内蒙、西藏等地区,因其富含黄酮类化合物,且具有抗肿瘤、抗氧化和消炎等功效,被广泛使用。而工厂对甘草中活性成分的提取通常采用水提法,造成甘草药渣中存在脂溶性黄酮类化合物未被有效提取,造成浪费。甘草药渣中富含木质纤维素,造成活性物质难析出,传统预处理木质纤维素的主要方法为超声辅助、微波辅助,但其耗能大、污染大,所以选择固态微生物发酵的方法对木质纤维素进行预处理,其主要优点有生产价格低廉、符合可持续发展理念、可工业化生产等。因此,本论文采用固态混菌发酵方法破坏木质纤维素的结构,促进甘草药渣中总黄酮的析出,进一步选择天然、绿色的低共熔溶剂进行总黄酮的提取,分离纯化获得含量最高的甘草素,并研究其在抗宫颈癌细胞Hela中的机制,获得了以下主要结果。(1)以产外切葡聚糖酶、果胶酶和漆酶能力为参照,通过单菌发酵和单因素实验筛选到产漆酶较高的白腐真菌和产果胶酶和外切葡聚糖酶较高的横梗霉菌为甘草药渣混合发酵菌株。研究获得了固态混菌发酵的最佳条件:白腐菌和横梗霉菌的接种比例为1:1,接种量10%,尿素和硝酸铵添加量(1:2)为20%,含水量50%。SEM证明混菌发酵破坏了甘草药渣原有的木质纤维素结构,FTIR进一步证明了混菌发酵表面蜡质的去除和半纤维素含量的降低。混菌发酵使甘草药渣中纤维素和半纤维素含量分别降低了0.7%和9.1%,使总黄酮得率提高了75%,并与未发酵甘草药渣相比,提取的总黄酮中检测到了甘草酮、异黄酮和甘草查尔酮A三种化合物。(2)为了选择高效绿色的黄酮提取溶剂,使用COSMO-RS理论筛选低共熔溶剂,筛选到氢键受体四甲基氯化铵、四乙基溴化铵、四丙基溴化铵和四丁基溴化铵,氢键供体乙二醇、乳酸和丙酸,作为甘草药渣中总黄酮提取的候选溶剂。以甘草素为模型化合物,优化确定了四丙基溴化铵为氢键受体和乙二醇与乳酸为氢键供体。通过响应面法优化低共熔溶剂对甘草药渣中总黄酮的提取效果,结果表明当以四丙基溴化铵与乙二醇作为提取溶剂,最佳溶剂摩尔比为1:1,含水量为50%,提取时间60min,提取温度80℃,料液比1:6时,相比传统乙醇提取方法,黄酮得率提高了49.4%,且其清除ABTS和DPPH自由基能力分别提高了21.2%和24.1%。(3)为了研究所提取的黄酮的生物活性,通过D101大孔树脂、MCI凝胶柱、ODS柱、Sephadex LH-20进行梯度洗脱,纯化总黄酮后,经液质和核磁鉴定获得了主要成分甘草素,其纯度达到95%以上。纯化后的甘草素运用于宫颈癌细胞的细胞毒性、细胞周期、细胞形态及相关基因通路和蛋白通路的凋亡机制研究,结果表明宫颈癌细胞周期为G2/M期,当甘草素浓度为300-900μg/ml时对癌细胞毒性及抑制率效果显著,细胞形态和数量随着甘草素浓度的增加发生皱缩和形态改变,并且ROS含量上升,使细胞减少发生应激反应促使癌细胞发生凋亡;其中重要的死亡受体通路,关键基因Caspase-8表达上调并进一步诱导死亡结构域TNFR1、DR5、Fas基因上调。研究表明,以固态发酵预处理甘草药渣为基础,使用低共熔溶剂提取具有最佳的黄酮得率与抗氧化活性,并且经过柱层析分离纯化后得到纯的甘草素对宫颈癌细胞具有更好的抑制效果和毒性,并且经过重要凋亡通路的研究表明线粒体通路与死亡受体通路相互影响。
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