最新的发育生物学研究证实,在颅神经嵴细胞分化形成牙颌骨器官的过程中,先后经历了颅神经嵴→第一鳃弓外胚间充质→牙颌骨外胚间充质两次关键性级联分化。本研究旨在建立Balb/c胎小鼠第一鳃弓外胚间充质细胞体外培养模型,在此基础上,进行多向诱导分化研究,鉴定其干细胞生物学特性。同时,构建第一鳃弓外胚间充质细胞牙向分化双向抑制消减文库,初步筛选、验证、分析差异表达基因,为全面揭示牙发生、发育的分子调控机制提供理论依据。 首先,精确解剖分离孕9.5天(E9.5)Balb/c胎鼠第一鳃弓,采用组织块法和改良酶消化法对其进行原代培养,利用反复贴壁和多次差异消化法对其进行纯化,通过细胞形态观察、细胞生长曲线描记、计算细胞倍增时间和特异性标记物检测对其细胞生物学特性进行研究。其次,利用端粒酶原位杂交荧光探针和Brdu摄取实验,检测第一鳃弓外胚间充质细胞的增殖和自我更新能力;取第3代细胞,更换不同的条件培养液,观察其在成脂、成内皮和矿化诱导液的刺激下,细胞形态学变化,并检测鉴定相应的特异性细胞表型标记,对细胞的可塑性进行研究。然后,在相同的培养条件下,收取第3代第一鳃弓外胚间充质细胞和E16.5下颌第一磨牙牙乳头细胞,采用抑制消减杂交技术,构建双向抑制消减文库,并对细胞的总RNA质量、双链cDNA酶切效果、接头连接率、抑制消减效率、差异基因的富集程度和载体连接效率进行全面质控分析。最后,在双向抑制消减文库中随机挑