目的:脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS),脓毒症的病情凶险,病死率高,全球每天约14,000人死于其并发症。脓毒症造成的急性肾损伤(Acute Kidney Injure,AKI)是导致脓毒症患者死亡的重要原因,AKI的发病率在所有重症加强护理病房(Intensive Care Unit,ICU)接诊患者中占15%到20%,由AKI进一步发展成为败血症并导致患者死亡的概率最高达60%,国外流行病学调查结果显示,脓毒症导致的病死率已经超过心肌梗死,成为导致ICU患者非心脏死亡的主要原因。脓毒症引起AKI的病理生理过程包括肾实质严重炎症、内皮功能障碍、肾小球内血栓形成和肾小管损伤。血管内皮功能障碍在脓毒症微循环障碍中起关键作用。当血管内皮细胞暴露于多种炎症介质后,内皮细胞结构改变,细胞连接丧失、多糖-蛋白质复合物的破坏导致了血管内皮受损,通透性增加,直接引起肾小球滤过屏障(Glomerular Filtration Barrier,GFB)损伤。GFB的损伤是AKI最重要的临床特征,维持肾小球内皮细胞通透性,缓解GFB的损伤对治疗脓毒症诱导的AKI有重要意义。青蒿素是复合花序植物黄花蒿的茎叶提取物,是一种包含有过氧基团的倍半萜内酯药物,由中国科学家屠呦呦在1971年首次发现。近年来研究发现,除了能够有效的治疗疟疾之外,青蒿素及其衍生物也有较好的抗炎作用。青蒿素及其衍生物SM905能够抑制胶原诱导的关节炎,说明青蒿素类药物具有治疗炎症相关疾病的潜力。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)是青蒿素的衍生物,作为青蒿素的代谢活性物质,在疟疾治疗方面具有高效且副作用少的特点。DHA能有效减轻小鼠狼疮性肾炎的症状。但对脓毒症引起的AKI的治疗作用还未见报道。本研究将重点探索DHA对脓毒症诱导的AKI的保护作用,通过构建脓毒症小鼠模型和体外细胞实验探索DHA对炎症介导的肾内皮细胞通透性升高的抑制作用及潜在机制。研究方法:1脓毒症模型的建立及处理:选取6-8周龄的雄性C57BL/6J小鼠,腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)(20 mg/kg)构建脓毒症小鼠模型,对照组注射磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline,PBS)。注射1小时后,分别对LPS和PBS组小鼠进行DHA灌胃治疗,同时设立对照组进行等体积的PBS灌胃。分组为:空白对照组,注射PBS,灌胃PBS;单纯DHA灌胃组,注射PBS,灌胃DHA;LPS+DHA组,LPS注射一小时后DHA(50 mg/kg)灌胃;LPS组,LPS注射一小时后等体积PBS灌胃。2尿白蛋白肌酐比值(Urine Albumin-Creatinine Ratio,UACR)和血肌酐值检测:灌胃处理24小时后,分别收集各组小鼠尿液,检测UACR值、对四组小鼠进行心脏取血,检测血肌酐值。3模型小鼠肾脏HE染色:完成尿液和血液样品收集后,处死小鼠分离肾脏,取小鼠肾脏做冰冻切片进行HE染色观察各组小鼠肾脏病理变化。4人肾小球内皮细胞(Human Renal Glomerular Endothelial Cells,HRGECs)通透性检测:在体外实验中,我们利用TNF-α(20 ng/mL)处理HRGECs24小时,模拟AKI条件下炎症因子对内皮细胞的影响,用25μM DHA、TNF-α(20 ng/mL)、TNF-α和DHA共同处理HRGECs 24小时后,通过异硫氰酸荧光素-葡聚糖transwell实验检测DHA、TNF-α处理对HRGECs的通透性的影响,同时观察25μM DHA与TNF-α(20 ng/mL)共同作用后对人肾小球内皮细胞的通透性变化的影响;ECIS实验检测用25μM DHA、TNF-α(20 ng/mL)、TNF-α和DHA共同处理24小时内HRGECs跨内皮细胞电阻的变化。5 HRGECs细胞凋亡率和细胞活力检测:HRGECs用25μM DHA处理24小时后,Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞仪检测25μM DHA对HRGECs细胞凋亡的影响;0.4%台盼蓝染色HRGECs,3 min内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞数,评估25μM DHA对HRGECs细胞活力的影响。6 HRGECs occludin表达量检测:用DHA、TNF-α、TNF-α和DHA共同处理HRGECs 24小时后,通过免疫荧光染色和Western blot技术来检测HRGECs中occludin的表达,初步揭示DHA抑制内皮细胞通透性的分子机制。结果:1脓毒症小鼠构建成功并造成了小鼠AKI:腹腔注射LPS 24小时后,小鼠UACR和血清肌酐值检测结果均较正常小鼠有明显升高;HE染色结果显示与正常对照组小鼠相比,LPS注射小鼠出现肾小球出血、水肿和炎性细胞浸润情况,表明成功构建了脓毒症小鼠模型并造成了小鼠急性肾损伤。2 DHA灌胃治疗降低LPS注射引起的UACR和血清肌酐值升高:各组小鼠于灌胃24小时后收集尿液检测分析发现,DHA单独处理组UACR与对照组小鼠相比没有明显变化,LPS注射组UACR值与对照组小鼠相比显著增加,但LPS+DHA处理组小鼠UACR值相比LPS处理组有明显的降低,并且有统计学意义。同样,我们取血检测各组小鼠血清肌酐值发现了与UACR值类似的变化结果。DHA单独处理组血清肌酐值与对照组小鼠相比没有明显变化,LPS注射组血清肌酐值与对照组小鼠相比显著增加,但LPS+DHA处理组小鼠血清肌酐值相比LPS处理组有明显的降低,并且有统计学意义3 DHA灌胃治疗对LPS注射引起的AKI有保护作用:取血后处死小鼠,分离肾脏,进行HE染色发现,单独DHA处理组肾小球正常,无明显变化。LPS注射组小鼠肾脏切片出现肾小球出血、水肿、炎性细胞浸润现象。LPS+DHA组,肾小球的完整性得以维持,与LPS注射组相比水肿得到缓解。4 DHA缓解TNF-α造成的HRGECs通透性增加:ECIS实验测量单层HRGECs跨内皮细胞电阻结果显示,DHA处理组跨内皮细胞电阻值与对照组相比无明显变化。TNF-α处理组HRGECs的实时跨内皮细胞电阻与对照组相比显著降低,但是TNF-α+DHA处理组的HRGECs跨内皮细胞电阻相比TNF-α处理组有明显的升高,且有统计学意义。异硫氰酸荧光素-葡聚糖Transwell通透性实验发现了相似的结果。DHA显著的降低了TNF-α诱导的HRGECs的通透性增高,且有统计学意义。5 DHA单独处理不影响HRGECs细胞凋亡率和细胞活力:流式细胞术测定DHA对细胞凋亡的影响发现,DHA处理组HRGECs凋亡率和对照组相比没有显著变化。台盼蓝排斥实验中,DHA处理组的活细胞百分比与对照组相比也没有显著变化。6 DHA缓解TNF-α造成的HRGECs occludin表达下降:免疫荧光染色和Western blot技术检测各组的occludin表达量结果发现,DHA处理组occludin表达量与对照组相比并没有显著变化,TNF-α处理组HRGECs occludin表达量显著降低,DHA+TNF-α处理组coolucin表达量较TNF-α处理组显著上升,且有统计学意义。结论:1在LPS诱导的小鼠脓毒症AKI模型中,口服DHA能够降低LPS诱导的UACR升高,AKI小鼠肾脏中肾小球出血、水肿和炎症细胞浸润的情况,同时口服DHA对正常小鼠肾脏没有影响,说明DHA本身对小鼠肾脏没有损伤,对AKI有治疗作用。2在TNF-α模拟的AKI炎症条件下,HRGECs通透性增加,DHA与TNF-α共同处理抑制HRGECs的通透性升高,说明在炎性条件下,DHA能够抑制TNF-α引起的HRGECs通透性增加。3 DHA不影响HRGECs的活性,不引发HRGECs凋亡,说明DHA本身对HRGECs没有毒性作用。4在TNF-α的作用下,紧密连接的重要组成蛋白occludin表达下降,DHA与TNF-α共同处理HRGECs后occludin表达恢复,DHA维持了炎症条件下occludin的表达,说明DHA可能是通过维持内皮细胞间的紧密连接蛋白occludin的表达,从而维持内皮细胞的通透性。意义:脓毒症是一种全身炎症反应综合征。治疗难度大、花费高,在消耗巨大医疗资源的同时给患者带来身心上的痛苦,严重影响患者的生活质量,威胁患者的生命安全。AKI是脓毒症最常见而严重的并发症。现阶段对于AKI的治疗主要以肾脏替代治疗(Renal Replacement Therapy,RRT)为主,药物治疗效果并不明显。因此,寻找治疗AKI的有效药物,对AKI的治疗有重大意义。青蒿素是一种广泛使用的抗疟药物,青蒿素及其衍生物同样表现出抗炎、抗血管生成和抗肿瘤作用。青蒿素能够有效的缓解小鼠狼疮性肾炎的症状。我们的此项研究结果显示,在小鼠脓毒症模型中,DHA能够有效的保护脓毒症引起的AKI;体外细胞实验也证实,DHA能够通过维持occludin的表达而降低TNF-α引起的HRGECs的通透性增加。同时我们发现,无论是在动物实验还在细胞实验中,DHA单独作用下对动物和细胞的生存状态与对照组没有显著差异。这些结果表明DHA有可能成为治疗AKI的有效药物。我们的研究结果为将DHA作为药物对脓毒症诱导的AKI进行治疗提供了实验支持和理论依据。