禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi(L.)属于半翅目Hemiptera蚜科Aphididae,是我国重要的小麦害虫之一,在我国南北各地及世界各小麦种植区均有分布。该虫以刺吸式口器吸取小麦汁液,为害小麦穗部及叶片,而且还能传播大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus,BYDV),严重影响小麦的产量,每年给世界各地的小麦生产造成重大经济损失,是严重危害农作物的最重要的蚜虫之一。吡虫啉是新烟碱类杀虫剂的代表药剂,具有广谱、高效、低毒、低残留等优点,且对害虫具有极高的触杀、胃毒及内吸活性,尤其对刺吸式害虫如蚜虫、飞虱、叶蝉、粉虱等有良好的防效,被广泛应用于我国麦类作物蚜虫的防治。随着吡虫啉的大量广泛使用,许多害虫对其均产生了抗药性。已有的抗性监测结果发现,我国部分地区禾谷缢管蚜田间种群对吡虫啉已产生了一定水平的抗性,而禾谷缢管蚜对吡虫啉的抗性机制还未见报道。本研究通过室内筛选禾谷缢管蚜对吡虫啉抗性及敏感品系,构建生命表进行抗性品系适合度的研究,明确禾谷缢管蚜对吡虫啉的抗药性发展动态;测定抗性品系筛选前后,禾谷缢管蚜对不同杀虫剂的敏感性变化,分析禾谷缢管蚜抗吡虫啉品系对其他杀虫剂的交互抗性;研究禾谷缢管蚜抗感品系主要解毒酶系酶活力变化;克隆了8个禾谷缢管蚜烟碱型乙酰胆碱受体亚基基因;分析田间种群烟碱型乙酰胆碱受体亚基基因的多态性;比较了吡虫啉抗性品系和敏感品系8个烟碱型乙酰胆碱受体亚基基因序列;研究了吡虫啉抗性品系和敏感品系8个烟碱型乙酰胆碱受体亚基基因和6个P450基因的表达变化。本研究结果对于禾谷缢管蚜对吡虫啉的抗药性治理及该虫的综合防治具有重要意义。主要研究结果如下:一、禾谷缢管蚜抗吡虫啉品系的筛选及适合度的研究本研究用吡虫啉对禾谷缢管蚜进行52代的室内抗性筛选,与相对敏感品系(Rp-S)相比,筛选后获得的抗性品系(Rp-R)的抗性倍数为40.35倍。在抗性筛选过程中,前24代(F0~F24)禾谷缢管蚜对吡虫啉的抗性发展较为缓慢,随后的筛选世代中,抗性上升较快,因此推测,禾谷缢管蚜在田间长期用药环境下具有对吡虫啉产生抗性的风险。利用禾谷缢管蚜抗性品系Rp-R第28代(F28)和第52代(F52)和敏感品系Rp-S,构建生命表对适合度进行了研究。研究结果显示,随着禾谷缢管蚜对吡虫啉抗性水平的升高,种群存活率和生殖力下降,若蚜发育历期延长,成蚜寿命缩短,净增值率、周限增长率和内禀增长率下降,且差异显著。通过内禀增长率评价抗性品系的适合度,相对于敏感品系,抗性品系F28和F52代的适合度分别是0.994和0.886,本研究结果表明,抗性品系表现出生长发育和繁殖的不利性,适合度明显下降,存在生存竞争劣势。二、禾谷缢管蚜抗吡虫啉品系的交互抗性研究通过比较禾谷缢管蚜抗吡虫啉品系rp-r在筛选前后对6种田间防治蚜虫常用药剂的敏感度变化,分析了该抗性品系对常用杀虫剂之间的交互抗性。研究结果显示,与相对敏感品系rp-s相比,抗性品系rp-r对噻虫嗪、啶虫脒和异丙威分别产生了10.72倍、6.21倍和6.30倍的抗药性,表现出明显的交互抗性;对马拉硫磷和毒死蜱的抗性倍数为3.42和2.48,存在低水平的交互抗性;对高效氯氟氰菊酯的抗性倍数为1.35,交互抗性不明显。三、禾谷缢管蚜对吡虫啉抗性生化机制分析以禾谷缢管蚜抗性品系筛选过程中的f52试虫为材料,并以敏感品系试虫作为对照,测定了增效剂磷酸三苯酯(tpp)、顺丁烯二酸二乙酯(dem)及氧化胡椒基丁醚(pbo)在禾谷缢管蚜抗性品系和敏感品系中对吡虫啉的活体增效作用;研究了f52代和敏感品系中主要解毒酶活力,初步分析了禾谷缢管蚜对吡虫啉产生抗性的生物化学机制。综合增效剂对吡虫啉的增效作用和解毒酶活力测定结果,分析认为,细胞色素p450单加氧酶和羧酸酯酶活力的增强是禾谷缢管蚜rp-r品系对吡虫啉产生抗性的重要生化机制。四、禾谷缢管蚜烟碱型乙酰胆碱受体基因的克隆及吡虫啉抗、感品系的序列比较本研究采用rt-pcr与race技术成功克隆了禾谷缢管蚜8个烟碱型乙酰胆碱受体(nachr)亚基,其中7个为α亚基,1个为β亚基,分别命名为rpα1,rpα2,rpα3,rpα4,rpα5,rpα7-1,rpα7-2和rpβ1亚基。氨基酸序列分析表明,8个基因编码的蛋白序列均具有nachr基因家族的典型结构特征。在亚基全长克隆中,发现rpα3和rpα5均存在选择性剪接。系统发育分析结果表明,8个亚基基因氨基酸序列分别与豌豆蚜、桃蚜、棉蚜和麦长管蚜各对应亚基氨基酸的序列同源性较高,进化关系较近。对f52代及敏感品系中的8个nachr亚基基因进行扩增和序列比较,未发现与抗性有关的氨基酸突变,说明在目前的抗性水平下,乙酰胆碱受体基因突变不是rp-r品系的主要抗性机制。五、禾谷缢管蚜田间种群nachrβ1亚基胞外区多态性分析β1亚基胞外区的突变与多种害虫对吡虫啉的抗性相关。本研究根据rpβ1亚基核苷酸序列设计特异性引物,采用rt-pcr技术,扩增了采自11个省的12个禾谷缢管蚜田间种群共120个个体和室内敏感品系10个个体的rpβ1亚基功能区的cdna片段。序列分析结果显示,田间试虫中共有17个核苷酸多态性位点,包括10个同义突变的核苷酸多态性位点和7个氨基酸突变位点,其中氨基酸突变位点w79c和v83i位于loopd环上。rpβ1亚基的变异位点产生的机制及其与禾谷缢管蚜对农药产生抗药性的关系有待下一步的工作中阐明。六、禾谷缢管蚜抗、感品系间烟碱型乙酰胆碱受体基因的相对表达量研究本研究采用荧光定量pcr技术,对禾谷缢管蚜nachr亚基基因在吡虫啉抗性品系中的相对表达量进行分析,结果显示,在吡虫啉抗性品系中,禾谷缢管蚜烟碱型乙酰胆碱受体8个亚基基因均有不同程度的表达,其中Rpα1,Rpα2,Rpα3,Rpα7-2和Rpβ1亚基基因表达量显著低于敏感品系,各亚基的表达量下调是否和吡虫啉抗性直接相关,还有待进一步验证。为了分析禾谷缢管蚜nAChR亚基基因在吡虫啉诱导后在转录水平的反应模式,本研究检测并分析了禾谷缢管蚜敏感种群在LC50浓度的吡虫啉处理后12h、24 h、36 h和48 h后nAChR亚基基因的相对表达量变化,研究结果表明,吡虫啉处理后,禾谷缢管蚜8个受体亚基基因的表达量均有不同程度的变化。七、禾谷缢管蚜抗、感品系P450基因的相对表达量研究本研究发现禾谷缢管蚜吡虫啉抗性品系中CYP6CY3-1和CYP6CY3-2基因以及Unigene 10092(CYP4家族基因)基因相对表达量分别上升了2.24倍、2.23倍和2.91倍,均显著高于敏感品系。由此推测,禾谷缢管蚜CYP6CY3-1和CYP6CY3-2基因以及Unigene 10092(CYP4家族基因)基因的表达量上调可能和禾谷缢管蚜Rp-R品系对吡虫啉抗药性有关。致死中浓度LC50吡虫啉处理禾谷缢管蚜无翅成蚜12 h、24 h、36 h和48 h后,6个P450基因CYP6CY3-1、CYP6CY3-2、Unigene 12972、Unigene 3757、Unigene3094和Unigene 10092均有不同程度的表达量上调,且在吡虫啉药剂处理12 h后,基因的相对表达量均上调至最大,吡虫啉药剂处理后的24 h、36 h和48 h后,6个P450基因的相对表达量由表达量上调逐渐回落,处理后至48 h,6个P450基因的相对表达量与对照组无明显差别。