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植物甾醇作为新资源食品,具有降低胆固醇含量、保护心血管健康、抗炎以及抗癌等功效,是国际营养学会推荐的未来十大功能性营养成分之一,被科学家们誉为“生命的钥匙”。但由于自身熔点高、溶解性差等性质导致生物利用度较低。通过与脂肪酸发生酯化反应获得的植物甾醇酯具有更好的脂溶性,吸收利用率比植物甾醇提高了5倍。当前植物甾醇酯工业化生产主要采用化学合成工艺,由于高温反应条件存在不可避免的脱水、氧化等副反应,导致产品分离纯化难、产物品质低等问题。而酶催化合成植物甾醇酯具有反应条件温和、绿色、选择性高等优点,备受学术界和产业界的关注。但酶法目前工艺尚不成熟,缺乏高性能的专用脂肪酶制剂,现有酶制剂稳定性低,成本高,不能满足工业应用要求,技术经济性差。另一方面,酶催化普遍需要较长的反应时间,传统酶法的反应混合物含有有机溶剂,会使产品的纯化和催化剂再利用的难度提高。本文以催化植物甾醇酯化效率最高的皱褶假丝酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase,CRL）为研究对象,通过酶分子修饰耦合新型固定化方法,对游离CRL的活性和稳定性进行调控,得到活性高、稳定性好的固定化CRL。并进一步将其应用到酶法合成植物甾醇酯中,结合超声预处理高粘度底物技术,以强化酶催化反应效率。主要内容如下:（1）选择了一种带有氨基官能团的新型离子液体（FIL,1-氨乙基-3-甲基咪唑溴盐）对脂肪酶进行表面化学修饰,并与酶交联聚集体（CLEAs）固定化技术相结合。结果表明获得的固定化脂肪酶CRL-FIL-CLEAs的动力学参数米氏常数（Km）值（4.80 m M）小于未添加修饰剂的固定化酶（CRL-CLEAs）（8.06 m M）,CRL-FIL-CLEAs对底物的亲和力提高。CRL-FIL-CLEAs（5.51U/mg protein）的活性是CRL-CLEAs的1.9倍。CRL-FIL-CLEAs受温度变化的影响降低,60℃处理50 min后,CRL-FIL-CLEAs仍保持了61%的活性,而CRL-BSA-CLEAs（BSA为修饰剂）和CRL-CLEAs的活性分别保留了42%和22%;CRL经固定化处理后,对环境酸碱性的稳定性提高;CRL-FIL-CLEAs重复使用5次后保留了51%的活性,而CRL-BSA-CLEAs和CRL-CLEAs残留活性仅为33%和22%;室温下储存四天,CRL-FIL-CLEAs保留了37%的活性,CRL-BSA-CLEAs和CRL-CLEAs分别保留了33%和32%。FT-IR图谱证实了CLEAs的成功制备。在SEM图谱中观察到脂肪酶固定化后的结构使底物分子更容易进入脂肪酶催化位点,减少了传质限制,从而提高了CRL-FIL-CLEAs的催化效率。以上结果表明,离子液体修饰的CRL-FIL-CLEAs是一种性能优异的酶制剂。（2）引入氨基功能化的磁性纳米粒子Fe3O4-NH2作为载体,构建了一种离子液体修饰的新型磁性交联酶聚集体（CRL-FIL-CLEAs@Fe3O4）。CRL-FIL-CLEAs@Fe3O4的活性提高至8.48±0.25 U/mg protein,是CRL-FIL-CLEAs的1.5倍。同时,CRL-FIL-CLEAs@Fe3O4热稳定性、储存稳定性、有机溶剂耐受性和重复使用性提高。室温下储存15天后,游离CRL仅残留28%的活性,而CRL-FIL-CLEAs@Fe3O4保留了73%的活性。CRL-FIL-CLEAs@Fe3O4在异丙醇、乙腈、乙酸乙酯和正己烷中可以保持88%以上的活性,重复水解棕榈酸对硝基苯酯11个循环后仍保留高达83%的水解活性。FT-IR结果表明,CRL-FIL-CLEAs@Fe3O4制备成功,VSM结果证明固定化酶具有超顺磁性。固定化后CRL-FIL-CLEAs@Fe3O4的二级结构发生了变化,α-螺旋的减少和β-折叠的增加使得蛋白质微环境的疏水性增强,活性中心暴露,加快了酶与底物的结合。热重分析（TGA）结果分析固定化酶的负载量为0.1627 mg protein/mg CRL-FIL-CLEAs@Fe3O4。分子动力学模拟结果表明,离子液体改变了酶活性中心的微环境。固定化前后,脂肪酶的RMSD值无明显变化,固定化酶在水解催化体系中的平衡性没有受到影响。（3）无溶剂体系中固定化脂肪酶催化植物甾醇与油酸的酯化反应,CRL-FIL-CLEAs@Fe3O4展现出了较高的甾醇酯化活性,并且超声预处理能够有效的强化无溶剂高粘度体系的传质过程,显著缩短反应的时间。优化后反应条件如下:预处理时间为15 min,超声功率为120 w,油酸与β-谷甾醇摩尔比为6:1,固定化酶用量为植物甾醇质量的10 wt%,反应温度为48℃,植物甾醇酯化率在9 h内达到了94.72%。核磁共振波谱结果明确了终产物为β-谷甾醇油酸酯。CRL-FIL-CLEAs@Fe3O4在连续5次重复使用后,催化酯化反应仍能保持80.02%的转化率。