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沙门氏菌是自然界中普遍存在的一种食源性致病菌,在世界各地的食物中毒事件中沙门氏菌引起的病例占第一位,沙门氏菌常引起人类急性腹泻、呕吐、腹部疼痛、高烧和败血症等疾病。沙门氏菌是革兰氏阴性肠道杆菌,无芽孢,周生鞭毛,需氧或兼性厌氧,最适生长温度为37℃,具有复杂的抗原结构,一般可分为菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原和表面(Vi)抗原3种。沙门氏菌危害巨大,严重威胁人类健康和社会经济的发展。因此建立一种快速、准确、简便的检测方法具有重要的现实意义。本研究旨在建立一种快速简便、特异性强的沙门氏菌免疫磁珠富集方法和双抗夹心ELISA快速检测方法。
以福尔马林灭活的鼠伤寒沙门氏菌和五株混合全菌抗原免疫雌性日本大耳兔,制备抗沙门氏菌多克隆抗体。分别采用辛酸.硫酸铵沉淀法和磁珠偶联抗原吸附法纯化抗体,所制备的抗体效价为3.2×105,纯度较高。采用斑点杂交方法检测抗体特异性,结果显示抗体交叉反应现象较严重。本实验以杂菌抗原反向吸附法纯化抗体,有效消除了抗体与杂菌的交叉反应,初步建立了一种高特异性多克隆抗体的纯化方法。
采用EDC和NHSS方法将磁珠与纯化后的多克隆抗体偶联,优化偶联条件和免疫磁珠捕获工艺。实验结果表明:每毫克磁珠最佳偶联抗体量为50微克,每次捕获105CFU/mL沙门氏菌使用免疫磁珠量为0.3mg,免疫磁珠捕获目的菌最佳孵育时间是45min,最佳磁分离时间是3min,受杂菌干扰小。在鸡蛋清、蛋黄、牛奶基质和纯培养中捕获效率分别为44.3％、43.2%、65.2%和72.5%。抗混合全菌多克隆抗体制备的免疫磁珠捕获鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌和肠炎沙门氏菌,捕获效率分别为61.4%、45.8%、48.2%、78.5%和64.1%。制备所得抗沙门氏菌免疫磁珠捕获效率较高,特异性较好。
本研究以抗沙门氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以C1360单克隆抗体作为检测抗体,建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法对沙门氏菌纯培养液的最低检测量为1.7×104CFU/mL,与其它肠杆菌不存在交叉反应,该方法具有良好的灵敏性和特异性。