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研究目的根据2014年世界卫生组织发表的全球癌症报告,全球癌症患者和死亡病例都在急剧地增加,中国新增癌症病例高居亚洲第一位。癌症已成为人类最主要的致死疾病之一,化学疗法是目前癌症治疗的主要手段,但是化疗副作用及其并发症给肿瘤病人的健康带来了极大的威胁,因此为开发具有高度特异性、更低副作用及更高效的抗肿瘤药物提供新的靶标和新的肿瘤治疗策略显得尤为重要。sirtuins家族蛋白因其与生物体的寿命相关,并且是一类可能的新型抗肿瘤药物靶点近年得到科学家们的广泛关注。哺乳动物sirtuins (SIRT1-7)是一类依赖于NAD+的Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶。转录后修饰和表观遗传修饰在调控蛋白活性方面起着重要作用,而蛋白活性的改变可能导致生物体代谢活动的变化,从而引起许多疾病,比如癌症。就目前的研究来看,sirtuins家族的蛋白在调控肿瘤发生中扮演着重要角色。一方面,这类蛋白可能作为肿瘤抑制因子发挥着其生物学功能。另一方面,还有证据证明sirtuins也能促进肿瘤发生。因此,有很多以sirtuins基因为靶点的化合物都涌现出来。在本研究中,我们使用了一种小分子化合物salermide,它是一种sirtinol的反向酰胺变构体并且能够抑制SIRT1和SIRT2的表达。sirtuins家族蛋白与自噬的关系是本课题的研究重点。自噬作为维持细胞内基本平衡的蛋白降解途径,有可能受到sirtuins蛋白的抑制或者促进。雷帕霉素机能靶蛋白(MTOR)在细胞自噬的调控中起着重要作用：MTOR受到抑制将激活细胞自噬。调控MTOR信号通路的分子有很多,内质网应激信号通路中某些关键因子如ATF4就可能扮演这样的角色。我们希望找到细胞内SIRT1和SIRT2调控细胞自噬的具体分子机制,并揭示在特定条件下肿瘤细胞自噬和凋亡之间的相互关系,以期找到一个新的抗肿瘤的药物的有效靶点和治疗肿瘤的新策略。研究方法1、点扫描激光共聚焦显微镜拍摄EGFP-MAP1LC3亮点聚集在图像水平上探究SIRT1/2与细胞自噬的关系。2、免疫印迹实验在蛋白水平上探究SIRT1/2与细胞自噬的关系。3、自噬抑制剂和ATG5、ATG7 siRNA干扰实验检测抑制SIRT1/2后引起的自噬流。4、ATF4、DDIT4 siRNA干扰实验和过表达实验探究内质网应激、MTOR信号通路与抑制SIRT1/2后引起的自噬的关系。5、免疫共沉淀实验探究SIRT1/2与内质网应激相关蛋白的相互作用。6、免疫共沉淀实验探究SIRT1/2各自与HSPA5结合的结构域。7、免疫印迹和流式细胞术探究抑制SIRT1/2后引起的细胞自噬与细胞凋亡的关系。实验结果1、salermide使人非小细胞肺癌细胞中EGFP-MAP1LC3亮点聚集增加并上调自噬标志蛋白MAP1LC3B-II的表达。2、抑制SIRT1和SIRT2使人非小细胞肺癌细胞中EGFP-MAP1LC3中的亮点聚集增加并上调自噬标志蛋白MAP1LC3B-II的表达。3、SIRT1和SIRT2受抑制后,通过上调ATF4的表达进而上调DDIT4的表达从而抑制MTOR信号通路最终诱导人非小细胞肺癌细胞发生自噬。4、抑制SIRT1和SIRT2后,其底物HSPA5乙酰化水平增加,从而HSPA5与SIRT1、SIRT2和EIF2AK3的结合减少,最终激活内质网应激反应。5、当抑制SIRT1和SIRT2所诱导的细胞自噬受到抑制后,细胞凋亡标志蛋白的切割和凋亡细胞比例显著增加。实验结论1、salermide能诱导人非小细胞肺癌细胞发生自噬。2、抑制SIRT1和SIRT2后能引起人非小细胞肺癌细胞发生自噬。3、抑制SIRT1和SIRT2后通过ATF4-DDIT4-MTOR信号通路诱导人非小细胞肺癌细胞发生自噬。4、SIRT1和SIRT2通过调控分子伴侣HSPA5的乙酰化从而调控其与EIF2AK3的结合,诱导细胞内的内质网应激反应。5、抑制SIRT1和SIRT2后诱导的细胞自噬起抗细胞凋亡的作用。综上所述,我们以人的肺癌细胞为模型,证明了当细胞内的去乙酰化酶SIRT1、SIRT2受到抑制后,细胞内的分子伴侣HSPA5的乙酰化程度增加,并与内质网膜上的受体蛋白EIF2AK3解离,从而导致内质网应激反应。内质网应激激活ATF4蛋白的表达,继而上调DDIT4的水平,使MTOR信号通路受到抑制,最终引起细胞自噬的发生。我们还发现SIRT1/2受到抑制后所诱导的自噬起抗细胞凋亡的作用。