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肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)又简称肾癌,起源于肾实质肾小管上皮细胞,是泌尿生殖系统中最为常见恶性肿瘤之一,在肾癌中最常见病理类型为肾透明细胞癌(CRCC)。CRCC治疗以根治性切除术(radicalnephrectomy, RN)为主,由于早期临床症状不明显,临床上以晚期患者为多。并且部分肾癌患者存在术后肿瘤复发或转移以及多耐药性,对放、化疗治疗不敏感,疗效不佳。免疫治疗由于长期疗效尚不能确定和总缓解率不高限制其广泛推广。因此深入研究肾细胞癌的增殖和侵袭的分子机制对提高早期诊断率和后续治疗疗效十分关键。葡萄糖调节蛋白78 (glucose regulated protein78, GRP78) 是 GRP家族中的重要成员,与热休克蛋白(heat shock protein70, HSP70)具有较高的同源性,属于HSP70家族成员之一。 GRP78在肿瘤细胞株和肿瘤组织如肝癌、结肠癌及肺癌、神经胶质细胞瘤等高表达,并可能与肿瘤的凋亡、耐药密切相关。但GRP78在肾细胞癌中的癌细胞增殖和侵袭等方面所起的作用尚未清楚。本研究在证实GRP78基因在肾癌细胞中呈明显高表达的基础上,初步提示了GRP78基因可能与肾细胞癌的发生发展存在相关。本实验首先成功构建好的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA),然后转染进入到表达GRP78基因的肾癌786-0细胞中。确认siRNA-GRP78在基因和蛋白水平可以有效抑制GRP78的表达。接着研究干扰GRP78基因后对于肾癌细胞增殖和细胞侵袭力的影响。通过RNA干扰法探讨GRP78基因后对肾癌786-0细胞的细胞增殖和侵袭力的影响,为今后肾癌的基因治疗提供一定的理论和实验基础。第一部分：慢病毒RNA干扰GRP78基因载体的构建及筛选目的探讨慢病毒RNA干扰GPR78基因载体的构建及筛选。方法构建慢病毒靶向siRNA-GPR78干扰载体并转染进入肾癌786-0细胞株。转染48h后利用Realtime-PCR和Western blot分别检沏G RP78mRNA和蛋白表达。筛选出一条抑制率最高的siRNA-GPR78进入下一步研究。结果Realtime-PCR结果显示与空白对照组(1.85±0.08)和阴：性对照组(1.79±0.15)比较,GRP78mRNA的表达水平在siRNAl(0.32±0.09)、siRNA2(0.83±0.07)以及siRNA3组(0.79±0.11)均降低,差异有统计学意义(P<0.01)；Western blot结果显示与空白对照组(1±0.03)或阴性对照组(1±0.07)比较,GRP78蛋白表达水平在siRNAI组(0.21±0.03)、siRNA2组(0.79±0.03)以及siRNA3组(0.86±0.04)均降低,差异有统计学意义(P<0.0 1)；空白对照组与阴性对照组的GRP78mRNA和蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。siRNA1抑制GRP78蛋白效率最佳。结论构建成功的siRNA-GRP78慢病毒载体可有效抑制肾癌786-0细胞中的GRP78基因及蛋白表达,以siRNAl抑制GRP78蛋白效率最佳,选择siRNA1进下一步研究。第二部分：RNA干扰GRP78基因对肾癌细胞增殖和侵袭力的影响目的探讨RNA干扰GPR78基因后对肾癌细胞的增殖和侵袭能力的影响。方法将siRNAl-GRP78干扰载体转染进入肾癌786-0细胞中。利用MTT法和Transwell法分别检测出肾癌细胞的增殖和侵袭力。结果MTT法检测结果显示与空白对照组和阴性对照组相比,siRNAl组肾癌细胞生长抑制明显,差异有统计学意义(P<0.01)。Transwell法检测结果显示与空白对照组和阴性对照组相比,siRNAl组肾癌细胞生长抑制明显,差异有统计学意义(P<0.01)。而阴性对照组与空白对照组比较,细胞的生长抑制不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。结论RNA干扰GRP78基因后,下调GRP78的表达,同时影响肾癌细胞的增殖和降低细胞的侵袭力。GRP78在促进肾癌细胞发生发展、细胞的增殖,以及维持细胞侵袭力等方面中可能起到重要作用。本研究也为以GRP78作为靶点的肿瘤基因治疗提供可靠的理论和实验基础。