背景动物背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)的慢性压迫(chronic compression of DRG, CCD)能够模拟临床上的椎间盘突出和椎管狭窄等症状,是一种典型的神经性疼痛模型。CCD大鼠能够产生自发性疼痛、机械性的异常疼痛和热痛觉过敏,伴随着受压迫神经元的动作电位和电流阈值降低、自发性放电增加。细胞内的第二信使环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)-依赖性的蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)和环磷鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)-依赖性的蛋白激酶G (protein kinase G, PKG)介导CCD大鼠的痛觉过敏和受压神经元的高兴奋性。多种离子通道被认为参与检测并传递持续受压后DRG神经元的伤害性刺激,如电压门控性Na+通道和K+通道、超极化激活性阳离子通道和TRPV4通道等,但CCD大鼠痛觉过敏出现时,伤害性信号传递的详细机制以及离子通道和第二信使之间的关系还不甚清楚。TRPV4是一种多觉型感受器,属于TRP超家族中的一员,可被低渗、机械刺激、热、佛波醇酯、低pH值、柠檬酸盐、anandamide (AEA)和其代谢产物花生四烯酸(arachidonic acid, AA)、以及bisandrographolide A (BAA)等激活。前列腺素E2(PGE2)可增强低渗(17 mOsm)或中度高渗溶液刺激(2%NaCl,607 mOsm)引起的机械性痛觉过敏和异常疼痛,TRPV4通道参与介导上述炎症性机械性痛觉反应。TRPV4基因敲除的小鼠表现出体液渗透压调节功能异常,对伤害性压力刺激的回避反应降低,但对非伤害性热和触觉刺激的反应正常。TRPV4基因敲除小鼠也表现出对炎症引起的热痛觉过敏降低。另外,TRPV4还参与介导神经痛模型中的机械性和低渗性痛觉过敏。TRPV4参与介导炎症性疼痛中的机械性、低渗性和热刺激引起痛觉过敏,还参与介导神经性疼痛中的机械性和低渗性的痛觉过敏,但TRPV4是否参与神经性疼痛中的热痛觉过敏还有待进一步研究。CCD大鼠DRG TRPV4的基因、蛋白表达均明显升高,且高表达的TRPV4参与介导CCD大鼠的机械性痛觉过敏,有利于低渗溶液或佛波醇4a-PDD引起DRG神经元Ca2+内流。一氧化氮合成酶(NOS)具有Ca2+依赖性,促进L-精氨酸合成一氧化氮(NO)。多个疼痛模型均证实NO是伤害性疼痛信号中的重要介质。TRPV4激动剂4a-PDD和低渗刺激均能增加豚鼠耳蜗外毛细胞内的NO合成,而TRPV4拮抗剂钌红则抑制NO的合成。TRPV4是一种渗透压感受器,能够通过谷氨酸突触连结调节下游效应器。NO则能通过cGMP-PKG信号通路增加谷氨酸的释放。另外,TRPV4激动剂4a-PDD和低渗刺激均能促进降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene-Related Peptide, CGRP)释放,并且随着NO增多,CGRP的合成和释放也相应增高。以上表明TRPV4可能与NO-cGMP-PKG信号通路有一定关系。再者,大量的文献已经证实NO-cGMP, cGMP-蛋白激酶G(protein kinase G, PKG)和NO-cGMP-PKG信号通路参与介导神经痛和炎症痛的痛觉过敏。因此,我们假设：CCD引起DRG内TRPV4通道活化、开放,促进钙离子大量内流,激活Ca2+依赖性的NOS,启动NO-cGMP-PKG信号通路,进一步促进疼痛介质谷氨酸和CGRP的释放。CCD后大鼠的疼痛反应可能通过这一信号通路起作用。本实验我们主要研究TRPV4在体基因沉默技术对CCD后大鼠行为反应和DRG内NO含量变化的影响,进一步确定TRPV4-NO-cGMP-PKG信号通路在CCD大鼠热痛觉过敏中的作用。目的研究TRPV4-NO-cGMP-PKG信号通路在CCD大鼠热痛觉过敏中的作用。方法1.建立CCD模型将大鼠随机分为CCD组和假手术组。大鼠戊巴比妥钠(50 mg／kg,腹腔注射)麻醉后,沿L4-S1棘突做后正中偏右切口,暴露右侧L4及L5椎间外孔,将“L”形棒的一端沿L4及L5椎间外孔的前壁上方水平插入椎管内,另一端位于椎管壁外。通过控制“L”形棒椎管壁外侧端使其椎管内端沿椎骨内壁缓慢下滑至椎管中部,使之挤压L4、L5 DRG。术后用生理盐水冲洗切口,依层缝合肌肉、腰背筋膜和皮肤,腹腔注射青霉素预防感染。假手术组除不插钢棒压迫神经节外,其余操作同手术组。术后大鼠没有发生自残现象,也没有表现出感觉完全缺失。2. TRPV4反义核苷酸干扰为了测量TRPV4反义核苷酸干扰对热痛阈值的影响,大鼠被随机分为假手术组和CCD组,每个组又分成对照组(control),反义核苷酸干扰组(antisense ODN group, AS group)和错配组(mismatch ODN group, MM group)3个亚组。假手术组中未接受任何处理的大鼠作为对照,CCD组中只接受CCD手术的大鼠作为对照。TRPV4 AS序列：5’-CATCACCAGGATCTGCCATACTG-3’; TRPV4 MM序列：5’-CAACAGGAGGTTCAGGCAAACTG-3’.ODN溶于0.9%的生理盐水(10μg/μl),注入蛛网膜下腔,40μg/d,每天一次,共7天。3.神经行为学测定于手术前连续测两天,每天一次。术后7天药物处理前2小时再次测量,排除痛觉表现不明显者(<5%),药物处理后1、2、4、8、24小时分别测量。对于鞘内注射ODN的大鼠,痛觉测量则在最后一次注射ODN12小时进行。热辐射刺激缩爪反应潜伏期(paw withdrawl latency)使用BME-410A型热痛刺激仪,将热痛刺激仪放在6mm厚的有机玻璃板下方,使光源聚焦照射动物后肢足底掌心,电子秒表记录从照射开始到引起后肢回缩反应时的潜伏期作为热痛觉观测指标。取每只大鼠5次测量结果的均值为统计数据。4. Western blotting检测从各组大鼠DRG中提取蛋白质,Western blotting检测TRPV4蛋白质表达量的变化。5.亚硝酸盐产物测量亚硝酸盐水平间接反应DRG内NO产物的含量,按照亚硝酸盐检测试剂盒进行操作。结果1. TRPV4拮抗剂钌红和TRPV4反义寡核苷酸(AS ODN)对CCD大鼠热痛敏及DRG NO衍生产物亚硝酸盐浓度的影响。与假手术组相比,CCD大鼠产生明显的热痛敏(F(1,112)=175.858,P<0.001),CCD术后7天大鼠DRG亚硝酸盐的浓度也显著增高(P<0.001)。鞘内注射不同浓度的TRPV4非选择性抑制剂钌红(0.01 nmol、0.1 nmol、1nmol)各20μl,分别测注射后0、1、2、4、8和24 h时的热刺激缩爪时间和亚硝酸盐浓度,结果显示：0.1-1 nmol的钌红对CCD后大鼠的热痛敏产生抑制作用(P<0.001),此抑制作用注射后1h可测得,4h作用达到最大,大约能够持续到8h,而0.01 nmol钌红无抑制作用(P>0.05)。与鞘内注射生理盐水组相比,1 nmol钌红组明显降低DRG亚亚硝酸盐浓度(P<0.001),4h作用最大,其浓度的变化与热痛觉反应呈正相关(r=0.997,P<0.05)。鉴于钌红非TRPV4特异性阻断剂,因此本研究加用TRPV4反义寡核苷酸(ASODN)来特异性抑有(?)TRPV4的表达。CCD术后7天AS ODN组TRPV4的表达显著抑制(P<0.001),而错配组(MM ODN)则无影响。行为学结果显示CCD、MM、AS组术前热刺激缩爪时间无差异(P>0.05),鞘内连续注射7天后,CCD和MM组缩爪时间较术前显著降低(P<0.001),AS组缩爪时间虽有所降低,但较术前无明显变化(P=0.059)。较MM组相比,AS组能明显降低CCD引起的亚硝酸盐浓度增高(P<0.001)。2.非选择性NO合成酶抑制剂L-NAME对CCD大鼠热痛敏及DRG NO衍生产物亚硝酸盐浓度的影响。鞘内注射L-NAME 30-300 nmol能够明显降低CCD后大鼠的热痛敏(P<0.001),抑制作用大约维持8h,4h时效应最大。L-NAME 300 nmol明显抑制CCD引起的亚硝酸盐浓度增高(F(2,120)=201.725,P<0.001),且最大抑制作用也出现在4h,8h后逐渐恢复正常,而D-NAME 300 nmol (L-NAME的同分异构体)却无上述作用。3.鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ和PKG抑制剂Rp-8-pCPT-cGMPS对CCD大鼠热痛敏的影响。50-100 nmol ODQ和25-50 nmol Rp-8-pCPT-cGMPS在鞘内注射后1、2、4、8h对CCD大鼠热痛敏均产生明显的抑制作用(both P<0.01)。4.TRPV4激动齐(?)4α-PDD对L-NAME的抑制作用鞘内注射300 nmol L-NAME能够明显抑制CCD引起的热痛敏和亚硝酸盐浓度增高,但1 nmol 4α-PDD能明显减弱L-NAME的上述抑制作用(P<0.001,P<0.05)。结论TRPV4-NO-cGMP-PKG信号通路参与介导CCD大鼠的热痛觉过敏。背景大量证据表明,NO是一种在外周和中枢神经系统内传递细胞内及细胞间信号的信号分子,能够感受病理状态下的伤害性刺激,在痛觉过敏的发生和持续过程中发挥重大作用。NOS有三种类型：神经元型NOS(neuronal NOS, nNOS),内皮型NOS(endothelial NOS, eNOS),诱导型NOS (inducible NOS, iNOS)。在有氧的环境下,NOS介导L-精氨酸生成NO。病理状态下,神经组织的NOS表达升高,NO是由NOS在一定的条件下合成,因此神经系统NO的病理作用可能受控于NOS表达的变化和活性的变化。在神经组织,nNOS主要表达于神经元内,促进NO的合成。多种神经痛模型实验已经证实nNOS诱导产生的NO参与介导伤害性疼痛过程。近年来,iNOS也逐渐成为研究神经痛病理机制的一个重要介质。有学者指出,iNOS在脊髓损伤后的痛觉高敏过程中发挥特殊作用,因此认为,iNOS在神经组织的高表达可能参与介导痛觉过敏过程。另外,神经组织内nNOS和iNOS在坐骨神经持续缩窄性损伤和脊神经结扎模型中表达升高,也证实了两者在神经痛中的作用。虽然已经有大量的证据表明nNOS和iNOS在上述两种神经痛模型的痛觉过敏中发挥作用,但是两者是否参与其它神经痛动物模型的痛觉高敏过程还不甚清楚。慢性背根神经节压迫(CCD)造成椎间孔狭窄、单侧椎间盘突出等功能障碍,从而引起放射性疼痛。我们在第一部分已经证实CCD大鼠DRG内NO合成增多,鞘内注射NOS非选择性抑制剂L-NAME能够降低CCD引起的热痛觉过敏,但哪种类型的NOS参与介导CCD大鼠的神经痛过程还不甚了解。我们还发现TRPV4,一种DRG内的机械和热感受器,参与介导CCD大鼠的NO合成。因此,本实验主要目的：探索CCD损伤后,哪些类型的NOS合成NO,参与介导大鼠的热痛觉过敏,及这些类型的NOS是否均与TRPV4相关。目的1.观察CCD对DRG nNOS和iNOS基因和蛋白表达的影响。2.明确TRPV4对nNOS和iNOS的作用。方法1.CCD手术68只大鼠随机分为假手术组(n=17)和CCD组(n=51),CCD组又分为术后对照组、MM组和AS组,每组17只。手术方法同论文一,术后7天或最后一次ODN注射后处理大鼠。2. TRPV4反义核苷酸干扰为了测量TRPV4反义核苷酸干扰对热痛阈值的影响和nNOS、iNOS表达的影响,MM组和AS组大鼠分别鞘内注射TRPV4 ODN,具体方法同论文一3.行为学测量分别在术前连续2天和术后7天或最后一次ODN注射12小时进行热痛觉过敏的测量。方法同论文一。4.实时定量PCR检测从各组大鼠DRG中提取RNA,实时定量PCR检测1iNOS、iNOS基因表达的变化。5. Western blotting检测从各组大鼠DRG中提取蛋白质,Western blotting检测nNOS、iNOS蛋白质表达量的变化。结果1.CCD对DRG内nNOS和iNOS基因表达的影响各组术前的缩爪潜伏期无差异(all P>0.05),但术后7天CCD组和MM组较术前缩爪潜伏期明显缩短(both P<0.01),且术后各组比较,AS组能够显著降低CCD大鼠的热痛觉过敏(P<0.01),证实TRPV4 AS ODN能够有效干扰TRPV4蛋白表达。术后7天或最后一次ODN注射12小时处死大鼠,取出DRG提取基因。CCD组的nNOS和iNOS的基因表达均明显升高(both P<0.01),分别是假手术组的4.94倍和4.44倍。2.CCD对DRG内nNOS和iNOS蛋白表达的影响结果显示：CCD明显上调nNOS和iNOS的蛋白表达(both P<0.01),分别为假手术组的4.69和4.65倍。3. TRPV4 AS ODN对CCD引起的nNOS和iNOS基因高表达的影响TRPV4 AS ODN能够明显降低CCD术后1nNOS和iNOS基因过表达(both P<0.01)。4. TRPV4 AS ODN对CCD引起的1nNOS和iNOS基因高表达的影响TRPV4 AS ODN能够明显下调CCD大鼠nNOS和iNOS蛋白高表达水平(both P<0.01)。结论1.CCD可以上调nNOS和iNOS的基因、蛋白表达。2.TRPV4对CCD引起的nNOS和iNOS的高表达发挥重要作用。背景背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)是机体初级感觉传入神经元胞体的聚集处,位于椎间孔内,当椎间盘突出和椎管狭窄等导致椎间孔狭窄时,易于受到压迫,从而产生后背痛和坐骨神经痛等临床症状。慢性压迫DRG(Chronic compression of the DRG, CCD)能够形象的模拟临床中的腰椎间盘突出和椎管狭窄等症状,被公认为是一种典型的神经痛动物模型。CCD大鼠可产生损伤侧的异常疼痛,并伴有神经元兴奋性的升高,表现为自发性放电增加和电流阈值降低。但是,这种异常疼痛和神经元的高兴奋性机制还不清楚。TRPV4是一种多觉感受器,可被低渗、机械刺激、热、佛波醇酯、低PH值、柠檬酸盐、anandamide(AEA)和它的LOX代谢产物花生四烯酸、和bisandrographolide A (BAA)等激活。TRPV4参与介导神经痛、炎症痛产生的机械性痛觉过敏和热痛觉过敏。我们前期已经发现,CCD后大鼠DRG TRPV4的基因和蛋白表达均增加,有利于痛觉过敏的产生和发展。P物质(Substance P, SP)和降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP),两者均为疼痛相关神经肽,参与伤害性信号的传递,产生机械性痛觉过敏和热痛觉过敏。有文献证实TRPV4在DRG与SP和CGRP共表达。在炎症痛模型中,TRPV4激动剂4a-PDD和低渗溶液均能刺激外周组织或脊髓背角释放SP和CGRP。早期的研究结果表明大鼠神经瘤释放SP需要钙离子参与,而CGRP的释放也需要钙通道的参与。另外,SP和CGRP主要在DRG合成。因此,有必要探讨TRPV4对CCD大鼠DRG内SP和CGRP产物的影响。目的1.观察CCD对DRG SP和CGRP基因和蛋白表达的影响。2.明确TRPV4对SP和CGRP的作用。方法1.CCD手术300只大鼠随机分为假手术组(n=75)和CCD手术组(n=225),CCD手术组又分为术后对照组(简称CCD组)、CCD+MM组(MM组)和CCD+AS组(AS组),每组75只。手术方法同论文一,术后7天或最后一次ODN注射后处理大鼠。2. TRPV4反义寡核苷酸干扰为了测量TRPV4反义核苷酸干扰对热痛阈值的影响和SP、CGRP表达的影响,MM组和AS组大鼠分别鞘内注射TRPV4 ODN,具体方法同论文一3.行为学测量分别在术前连续2天和术后7天或最后一次ODN注射12小时进行热痛觉过敏的测量。方法同论文一。4. Western blotting检测从各组大鼠DRG中提取蛋白质,Western blotting检测TRPV4蛋白质表达量的变化。5.实时定量PCR检测从各组大鼠DRG中提取RNA,实时定量PCR检测SP、CGRP基因表达的变化。6.ELISA检测DRG SP和CGRP的含量此方法主要检测CCD引起SP、CGRP蛋白高表达是否与TRPV4有关。大鼠处死后迅速取出DRG放入液氮中,三只大鼠6个DRG作为一个样本,-80℃保存备用。提蛋白,BCA法测量蛋白浓度,按照SP、CGRP试剂盒说明书要求分别测量。7.免疫组化大鼠麻醉后经颈动脉灌注4%多聚甲醛固定,迅速取出DRG,4%多聚甲醛固定7-8小时,经过脱水浸蜡过程将组织石蜡包埋,切成厚约5微米的石蜡切片,行SP、CGRP的免疫组化染色。结果1. TRPV4反义寡核苷酸(AS ODN)对CCD大鼠热痛敏的影响和DRG TRPV4蛋白表达的影响。各组术前的缩爪潜伏期无差异(all P>0.05),但术后7天CCD组和MM组较术前缩爪潜伏期明显缩短(both P<0.01),且术后各组比较,AS组能够显著降低CCD大鼠的热痛觉过敏(P<0.01),Western blotting结果证实TRPV4 AS ODN能够有效干扰TRPV4蛋白表达(P<0.01)。2.TRPV4AS ODN对CCD大鼠DRG内SP.CGRP基因表达的影响实时定量PCR结果显示CCD能够明显上调SP.CGRP的基因水平(both P<0.01),AS ODN处理后,SP.CGRP的基因水平较假手术组无明显差异。而MM组较假手术组相比,SP.CGRP的基因水平则明显增高(both P<0.01).3.TRPV4AS ODN对CCD大鼠DRG内SP.CGRP蛋白表达的影响ELISA和免疫组化结果均显示：CCD组SP.CGRP的蛋白表达较假手术组明显增高(both P<0.01),AS ODN能明显降低CCD后SP、CGRP高蛋白水平(both P<0.01),MM ODN则不能。结论1.CCD可以上调SP和CGRP的基因、蛋白表达。2.TRPV4对CCD引起的SP和CGRP的高表达发挥调控作用。