研究背景从二十世纪中期开始,作为重要金属化合物的有机锡类物质就被广泛的应用于工业、农业、海洋业等。其中,三丁基锡(Tributyltin,TBT)是有机锡类化合物中应用最广泛的一种。塑料制品稳定剂、船舶防污剂等的生产过程中都有TBT的参与,此外TBT还可应用于工农业杀菌、杀虫以及木材防腐的过程中。由于TBT具有生物杀生作用,20世纪60年代初被作为防污剂加入船舶涂漆中以防止水生生物对舰船、船坞、码头等的附着寄生。由于TBT不断扩散、迁徙进入周围水体并沉降入水体底泥中,导致其在水生系统中广泛存在。大量的水生态调查和实验研究显示,TBT是一种内分泌干扰物,可引起海洋腹足纲生物性畸变,导致水生环境生态灾难,从而受到了众多研究者的关注。基于对生态环境的严重危害,国际上开始逐渐禁用TBT。其中,《控制船舶有害防污底系统公约》由国际海事组织于2003年颁布,规定自2008年起不允许将TBT用于船只的防污。TBT禁令后,虽然TBT应用量大大降低,但因缺乏相应替代品,一些发展中国家和未加入国际海事组织的国家仍然使用含有TBT的涂料。此外,TBT还继续用于管道材料和木材防腐剂等。因此,TBT仍存在相当广泛的新发污染源头。除新的污染源之外,之前由于大量使用造成的TBT残留问题也不容忽视。TBT与其他很多EDCs一样,其污染具有持久性的特点。它在底泥中的半衰期较长,虽然在水里的半衰期仅有约6个周-5个月的时间,但于沉积物中则可达数十年之久。在近海、港湾以及内河港口的水低淤泥中仍有大量的TBT残留,在较长的时间里不断的向水体散发TBT,是TBT的持续性污染源。因此,TBT污染在以后较长的时间段里仍然广泛存在。TBT的持久性、脂溶性特性使其可借助食物链进入到人体。TBT具有极强的亲脂性和蓄积性,易通过食物链富集,通过生物放大作用,从而在人体体内达到较高的浓度。人类可以通过食用海产品;饮用受TBT污染的水、饮料;吸入室内粉尘;以及接触含有TBT的工业用品等方式暴露于TBT。其中,通过食物链经口摄入是最主要的途径。大量的研究显示TBT对水中生物以及陆地哺乳动物都会产生内分泌干扰作用。TBT还是一种典型的环境肥胖因子,在纳摩尔浓度下即可诱导脂质分化的关键因子—过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)的表达,进而诱导脂肪增生以及肥胖的进展。此前的一些研究显示TBT可导致实验动物肥胖、代谢紊乱,但对于其作用机制的研究较少。已有的证据显示肥胖的发生与慢性炎症关系密切。此外,氧化应激状态和内质网压力(也称为内质网应激)(Endoplasmic reticulum stress,ER stress)在代谢性疾病的发展中起着重要的作用。而细胞核转录因子-κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)信号通路作为炎症的关键通路,即与内质网压力密切相关,又能被氧化应激激活,从而在代谢紊乱的发展中发挥作用。因此,本次实验主要研究TBT是否通过内质网应激和氧化应激干扰NF-κB信号通路,促进炎症发展,导致大鼠肥胖以及代谢紊乱。目的环境内分泌干扰物的慢性、长期、低剂量暴露对动物乃至人类的生长、发育等产生的毒性效应已成为整个社会关注的焦点;但是,在对这些污染物的健康风险研究以及生态研究过程中,弄清楚其产生毒性效应的具体机制以及它们的干扰内分泌的作用如何对生态环境施加效应更值得深入研究。本文通过TBT对大鼠代谢影响的机制研究,来探讨TBT的慢性毒性效应,有助于加深对TBT等环境内分泌干扰物对人类健康危害效应的研究;从而,对解决TBT造成的健康危害以及日益严重的内分泌干扰物污染造成的危害,提供一个可能的方向。本课题将从以下几个角度来探析TBT长期低剂量暴露对大鼠代谢的影响以及相关机制:1)TBT对大鼠脂肪与糖代谢的影响:监测SD大鼠TBT暴露后的体重、内脏脂肪(肾周和附睾脂肪)质量变化;检测血脂、脂质代谢中间产物含量改变,以及对糖代谢影响。2)TBT对NF-κB信号通路的影响:通过免疫组化检测肝组织巨噬细胞变化、利用Western Blotting实验检测TBT暴露对肝组织中炎症关键调节因子NF-κB信号通路的影响。3)TBT对NF-κB密切相关的氧化应激以及内质网应激反应的干扰:检测组成大鼠抗氧化防御系统的酶、非酶类物质以及内质网应激的生物标志。4)分析TBTCl暴露诱发的大鼠肥胖以及代谢紊乱与NF-κB信号通路、氧化应激、内质网应激之间的可能的调控关系。方法1.实验大鼠饲养及处理将21日龄雄性无特定的病原体(specific pathogen free,SPF)级的SD大鼠根据体重随机分为4组,每组10只。适应性喂养3天后,从出生后24天(Postnatal Days,PNDs24)开始,用溶于玉米油的氯化三丁基锡(TBTC1)(其浓度剂量分别为0,0.5,5和50 μg·kg-1),每3天进行一次灌胃处理。在任何一次灌胃之前都对大鼠过称并记录其体重,以此调整染毒所需的药物体积。PNDs84最后一次染毒TBTC1,所有的大鼠继续正常喂养10天,于PNDs 94麻醉。腹主动脉处取血,室温下静放1小时后,2500 rpm*10分钟分离血清并储存于-80℃备用;解剖、分离肾周和附睾脂肪组织,天平过称并记录。分离大鼠肝,部分用4%多聚甲醛液固定,其余肝组织放入液氮快速冷冻后于-80℃冰箱中储存备用。2.葡萄糖耐量试验大鼠处死前第三天进行葡萄糖耐量试验(Glucose tolerance test,GTT)。每组随机选择五只大鼠用于GTT。大鼠禁食过夜后,按照2g/kg体重的标准,腹腔处注射葡萄糖。注射前采尾静脉血,用罗氏血糖仪检测血糖浓度作为0 min时的血糖水平。在注射后的15、30、60和120 min时分别于尾大鼠尾巴静脉处采血测定血糖浓度。并利用葡萄糖耐量血糖曲线下面积(Area under curve,AUC)水平,评估实验大鼠利用血糖的能力。3.胰岛素耐量试验与GTT相同,同样在大鼠处死前第三天进行胰岛素耐量试验(Insulin tolerance test,ITT)。每组随机选取检测GTT的大鼠后,剩余的5只大鼠用于ITT,方法为将大鼠禁食两个小时,然后按照1 U/kg体重的剂量注射胰岛素。分别于0、15、30、60和120分钟时于大鼠尾部静脉处采血来测量大鼠的血糖水平,最终计算出AUC以评估大鼠胰岛素耐量状况。4.大鼠取血及血清相关指标检测GTT和ITT检测后的大鼠继续喂养3天后麻醉取血,获得大鼠血清后,使用Beckman Coulter AU480自动分析仪测量大鼠血中低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(Highdensity lipoprotein,HDL)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)的含量。使用对应试剂盒分别检测血清中游离脂肪酸(Free fattyacid,FFA)、脂质的过氧化产物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)以及抗氧化相关指标,包括谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)。5.肝脏HE肝脏经24h的4%多聚甲醛固定后,制作切片进行苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining,HE)以观测肝脏组织结构情况,观察TBT暴露对大鼠肝脏组织结构变化的影响。6.肝组织免疫组化运用免疫组化的方法检测肝脏中巨噬细胞的经典标记物CD68分子,以观测分析TBTCl暴露对大鼠肝组织巨噬细胞的影响。7.Western Blotting检测相关蛋白Western blotting检测了肝脏组织中NF-κB信号通路的标志分子NF-κB 1(P105/P50)、NF-κB 2(P100/P52)、NF-κB P65及其磷酸化型蛋白的表达情况,探讨TBT暴露对NF-κB通路的影响。同样运用Western blotting检测内质网应激的生物标志,包括结合免疫球蛋白(Binding immunoglobulin protein,BiP)、肌醇酶-1α(Inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)、内质网氧化还原酶 1-Lα(Endoplasmic reticulum oxidoreduclin 1-Lα,Erol-Lα),探析 TBT 暴露是否引起未折叠蛋白反应,造成内质网压力。结果1.TBTCl暴露致大鼠附睾脂肪和肾周脂肪重量增加实验过程中,各组大鼠活动表现正常,无戕毛、消瘦、死亡等状况。在整个实验检测时间内,四组大鼠的体重之间没有较大差别。实验结束时,大鼠的肾周、附睾脂肪重量均呈剂量依赖性增加。其中50 μg·kg-1组大鼠相较于对照组,附睾脂肪重量增加了 49.3%(P<0.05),肾周脂肪质量增加了 64.4%(P<0.05)。2.TBTCl暴露对大鼠血脂水平的影响对大鼠的血清中HDL、TC、LDL和TG的水平进行测定的结果显示,TBTCl处理导致血清中TG含量上升,50μg·kg-1组显著高于对照组(P<0.05)。各处理组血清TC、HDL和LDL含量和对照大鼠相比较无明显的变化。对血清里脂质代谢的中间产物FFA的检测结果显示TBT暴露增加了 FFA的水平,50 μg·kg-1组比对照组明显升高(P<0.05)。3.TBTCl暴露对大鼠糖代谢的影响GTT结果显示,在30 min时,5 μg·kg-1组大鼠血糖浓度明显高于对照大鼠(P<0.05);在60 min时,5μg·kg-1组和50μg·kg-1组大鼠血糖浓度均显著高于对照组(P<0.05),而这两组染毒组的GTT-AUC也都高于对照组(P<0.05)。这表明TBT暴露降低了大鼠葡萄糖利用率并导致糖耐量异常。ITT试验中,在30min时,5μg·kg-1组和50 μg·kg-1组大鼠的血糖浓度下降幅度较小;在60 min和120 min时,5 μg·kg-1组和50μg·kg-1组大鼠血糖浓度仍明显的高于对照大鼠(P<0.05);两组的AUC与对照组相比也明显的增大(P<0.05)。这表明在TBT暴露的条件下,大鼠的胰岛素耐量受损,对胰岛素的敏感性降低。4.TBTCl暴露致大鼠肝组织结构异常且巨噬细胞增多大鼠肝组织HE切片显示,TBTCl暴露组均出现不同程度的肝细胞索紊乱,肝窦扩张淤血,肝小叶和汇管区观察到大量的炎性细胞浸润,部分肝细胞肿胀,发生了水泡变性、坏死,还有部分肝细胞表现为嗜酸性变,可观察到点状的坏死。大鼠肝脏巨噬细胞标志物CD68的免疫组化结果显示,50 μg·kg-1组阳性细胞数远远高于对照(P<0.001),表明TBTCI暴露后大鼠巨噬细胞增多。5.TBTCI暴露致大鼠氧化应激改变对大鼠血清以及肝脏中氧化应激的标志物进行了检测。结果表明,大鼠血清和肝组织中MDA含量均成剂量依赖性上升,且50 μg·kg-1组比对照组升高显著(P<0.05)。在血清中,5 μg·kg-1组和50 μg·kg-1组SOD活力显著降低(P<0.05);5 μg·kg-1 组和 50 μg·kg-1 组 CAT 活力也显著降低(P<0.05;P<0.01);,0.5 μg·kg-1组的GSH含量明显减少(P<0.05)。在肝脏中,50 μμg·kg-1组SOD活力明显降低(P<0.05);三组暴露组中CAT活力均显著降低(P值分别<0.001,<0.05,<0.01);50μg·kg-1组中GSH含量明显减少(P<0.05);三组暴露组中GSH-PX的活力也都显著降低(P值分别<0.05,<0.01,<0.05)。这些结果表明,TBT暴露大鼠抗氧化防御系统受损,导致氧化应激改变。6.TBTCl暴露致大鼠肝脏内质网应激运用Western blotting方法检测了大鼠肝脏组织中的内质网应激标志分子,结果显示0.5μg·kg-1组BiP、IRE1α Ero1-Lα三者相较于对照大鼠都有极大的降低(P<0.05),而在 5 μg·kg-1 组中 IRE1α 和 Ero1-Lα 以及 50 μg·kg-1 组中 BiP、IRE1α、Ero1-Lα均明显增多(P<0.05)。这些结果证明TBTC1暴露诱导了大鼠肝脏内质网应激。7.TBTCl暴露扰乱 NF-κB 信号通路同样用Western blotting检测了肝脏组织中NF-κB通路的关键分子。三个染毒处理组中磷酸化NF-κB P65与NF-κB P65的比例与对照组相比均明显升高(P<0.05),这表明磷酸化NF-κB P65形式增多,NF-κB信号被激活。我们又进一步检测了NF-κB 1(P105/P50)、NF-κB 2(P100/P52),结果显示,5μg·kg-1组和50 μg·kg-1组中P105/P50的比例与对照大鼠相比明显降低(P<0.05),三个染毒组中P100/P52的比例与对照大鼠相比也都有降低(P<0.05)。这表明,TBT暴露不仅激活了 NF-κB 1(P105/P50)参与的NF-κB经典信号通路,还干扰了 NF-κB 2(P100/P52)参与的NF-κB非经典信号通路。研究结论在青春期长期低剂量暴露于TBT可能通过诱导氧化应激和内质网应激扰乱NF-κB信号通路,导致大鼠肝组织损伤,肝脏巨噬细胞数目增多,从而产生慢性炎症,导致大鼠肥胖、糖代谢紊乱以及脂质代谢异常。