第一部分诱导性多能干细胞移植改善猪心肌梗死后心脏功能及其机制研究背景：心血管疾病,尤其是急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI),严重影响病人的生活质量,是发达国家的首位死亡原因,也是发展中国家疾病负担的主要原因之一。既往研究显示包括骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)在内的多种干细胞均对缺血性心脏病有治疗作用,但一直未在临床大规模应用。诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPS),2006年首次被日本科学家发现,具有类似胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESC)的全能性,无ESC的道德伦理争议,且其来源广泛,避免了免疫排斥反应,具有广阔的应用前景。小动物心肌梗死实验显示,iPS具有治疗缺血性心脏病的作用。但小鼠心血管系统,尤其是造模后,与人类有着显著的差异,iPS细胞能否应用到临床,需经过在生理、功能和解剖上与人类相似的大动物模型的实验验证。目的：探讨猪源性iPS细胞移植后对猪心肌梗死后心脏功能的影响,并探讨移植后iPS的在体存活、分化及其改善缺血性心脏病心脏功能的作用机制,为iPS细胞临床应用于急性心肌梗死及其安全性提供理论依据。方法：26只苏中猪(24.83±2.52kg)分为3组：Sham正常组、PBS对照组、iPS细胞移植组。通过左前降支冠状动脉(Left anterior descending artery, LAD)球囊封堵90分钟制备AMI模型,通过心电图、左心室造影、血浆肌钙蛋白验证动物模型构建是否成功。造模前,使用单光子发射计算机断层显象(Single Photon Emission Computed Tomography, SPECT)检测基础心肌灌注。提前培养足够数量的猪源性iPS细胞,AMI造模成功一周后开胸,iPS细胞移植组随即于梗死区和梗死周边区心肌内注射猪源性iPS2ml(含2x107个细胞),PBS对照组以相同方法注射2ml PBS液体,Sham正常组置入球囊、导管,但不封堵,一周后开胸,但不行任何干预。在iPS细胞或PBS注射1周、6周后以SPECT和心脏双源CT (dual source CT, DSCT)检测评价心肌灌注缺损和心功能；Masson’ Trichrom染色评价心肌纤维化程度；免疫荧光检测移植细胞在体存活和分化；TUNEL法检测心肌细胞凋亡；以Westen Blot免疫印迹法检测心肌组织促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平。结果：(1) SPECT扫描显示,基线时各组心肌灌注无缺损面积无显著差异。细胞移植1周后,iPS细胞组和PBS组心肌灌注缺损面积无显著差异(13.50±2.07vs.14.50±1.87,P=0.40),但较Sham对照组明显减低(P<0.05)。细胞移植6周后,iPS细胞组心肌灌注分数明显较PBS组提高(iPS组vs. PBS组,19.33±4.97vs.13.67±2.94,P=0.04),但是仍然低于Sham对照组(iPS组vs. Sham对照组,19.33±4.97vs.27.67±0.52,P<0.01)。(2) DSCT心功能检测显示,细胞移植1周后,与Sham组相比,iPS组和PBS组左室射血分数(LVEF)明显下降(P<0.001),但iPS组和PBS组LVEF相比,无显著统计学差异(iPS组vs. PBS组,51.72±3.09vs.51.25±3.94,P=0.82)。细胞移植6周后,iPS细胞组的LVEF较PBS组明显改善,具有显著统计学差异(iPS组vs. PBS组,56.68±4.44vs.50.93±3.91,P=0.04),但是仍然低于Sham对照组(iPS组vs. Sham对照组,56.68±4.44vs.63.37±3.26,P=0.01)。(3)HE染色和Masson’ Trichrom染色显示,在PBS组,梗死区呈连续性大片状纤维化,有较多炎性细胞浸润,未见存活心肌细胞。iPS组梗死区纤维化和炎性细胞浸润显著减轻,存活心肌较多,纤维化呈散在分布。iPS细胞移植组梗死周围区域纤维组织显著低于PBS组(P<0.05)。电镜检查也发现,iPS细胞移植可以改善梗死后心肌细胞超微结构。(4)免疫荧光显示,iPS细胞可以分化为血管细胞,从而促进心脏梗死区和梗死周边区血管再生。免疫组化显示,iPS移植组梗死区血管密度显著高于PBS组和Sham组(PBS组vs. iPS组,11.09±3.93vs.26.38±8.17,P<0.001；Sham组vs. iPS组,2.31±2.08vs.26.38±8.17,P<0.001)。(5)终点时,TUNEL染色示,无论在梗死区还是在梗死周边区,iPS组凋亡细胞数量较PBS组明显降低。Western Blot检测表明,PBS组梗死周围区促凋亡蛋白Bax表达显著增加(P<0.05),抑凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低(P<0.05)；和PBS对照组相比,iPS移植组使Bax表达降低,使Bcl-2表达增加。(6)病理学检查显示,iPS细胞移植后第7周甚至是第4个月时未见到肿瘤形成。结论：(1)iPS细胞移植可以改善猪心肌梗死后的心脏左室功能和心肌血流灌注；(2)iPS细胞移植可以降低猪心肌梗死后胶原纤维在心肌中的沉积,减轻心肌纤维化,从而减轻心肌梗死后重构；(3)iPS细胞移植后可以分化为血管细胞并显著促进猪心肌梗死后血管的形成,这可能是iPS细胞移植改善猪梗死后心功能的重要机制；(4)iPS细胞移植可以抑制猪心肌梗死后梗死区、周边区心肌细胞凋亡的发生。第二部分诱导性多能干细胞移植对猪心肌梗死后心电生理的影响及其机制研究背景：虽然大多数研究显示干细胞细胞移植可以改善缺血性心脏病的心功能,但对于细胞移植能否改善心电基质,能否减少心肌梗死后的恶性心律失常,亦或是促进心律失常的发生,目前仍存在着争议。iPS细胞作为一种新型类ESC的干细胞,在应用于临床之前,为安全起见,必须首先探讨其对心脏电生理的影响。目的：观察iPS细胞移植后对猪心肌梗死后心脏电生理的影响,并探讨其潜在的作用机制。方法：通过左前降支冠状动脉(Left anterior descending artery, LAD)球囊封堵90分钟制备猪AMI模型,一周后开胸,直视下心肌内注射2ml iPS细胞(2x107)或PBS液。细胞移植7周后以体表十二导联心电图分析心电参数变化；以CARTO系统进行三维电解剖标测,比较各组电解剖差异；以程序电刺激(Programmed Electrical Stimulation, PES)测定室性心律失常(Ventricular Arrhythmias, VAs)诱发率；通过Masson染色测定组织纤维化,心脏胶原沉积；同时观察心脏中Cx43蛋白表达及其分布,观察心脏自主神经相关蛋白如酪氨酸羟化酶(TH)、生长相关蛋白43(GAP43)、乙酰胆碱酯酶(ACh)的形态分布及表达变化。结果：(1)与PBS组相比,iPS组心电图参数如HR、RR间期、P波时限、PR间期、QRS时限、QTcD均无明显差异。(2)细胞移植7周后,CARTO系统标测显示,PBS组猪心肌梗死后左心室红色的瘢痕坏死心肌组织和黄色的缺血心肌组织较大,而iPS组猪左心室红色的瘢痕坏死心肌组织较少。(3)细胞移植后第7周,PBS组6只猪中有3只可诱发出室性心律失常,且有2头诱发出室颤。iPS细胞移植组仅有1头能诱发出了室速并发生了室颤,两组之间差别没有统计学意义(50.0%vs.16.7%,P=0.545)。(4)心肌梗死后梗死周边区Cx43蛋白表达显著下降,分布紊乱,iPS细胞移植部分纠正这些异常。(5)心肌梗死后梗死周边区TH、GAP43蛋白表达显著上升,交感副交感神经纤维支配失衡,分布紊乱,iPS细胞移植可以部分改善这些神经重构。结论：(1)iPS细胞移植可以改善心肌梗死后心电基质；(2)iPS细胞移植并不能降低VAs诱发率,但也无致心律失常性；(3)iPS细胞移植可以改善Cx43表达和分布；(4)iPS细胞移植可以改善心脏神经重构,对降低心肌梗死后心律失常的发生有重要的作用。