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探索精子细胞的高敏感高特异性新检测方法对于实现法医学中精斑的确认与个体识别具有极其重要的意义。传统的精斑、精子检测方法主要有通过镜检观察精子的细胞形态,抗原抗体反应或者检测精斑中特殊含量的酶等。确定精斑后,可通过差异裂解等方法分离出精子DNA,再进行精子DNA扩增与后续DNA分型。这些方法往往因为杂质(包括女性阴道上皮细胞DNA)的干挠而存在敏感性低,甚至假阳性等局限性。核酸适体(aptamer)因其亲和力高、特异性强、合成经济、易保存,可通过荧光基团等修饰使其与靶标的结合成为可视性等优点,被用作为一类新型分子探针,即可用来作为识别探针,也可用来构建捕捉工具,广泛地应用于细胞的检测和富集中。本课题体外合成长度为84个碱基(包含已知序列的上、下游引物各22个碱基)的随机单链作为初级文库,通过全细胞改良指数富集的配基系统进化(cell-SELEX)技术筛选出7条与精子细胞特异性结合的单链DNA适体,利用Clustal2.05、mfold软件对DNA适体序列进行一级结构同源性分析和二级结构预测,然后采用荧光标记法检测单链DNA适体与精子细胞的特异性结合,挑选出与精子细胞特异性结合的A-3适体进行精子细胞富集实验。精子细胞富集实验中将生物素修饰的A-3适体固定在链霉素磁珠上,通过生物素-链霉亲和素的作用,制备了能特异性捕获、富集精子细胞的A-3适体功能化磁珠。该A-3适体功能化磁珠捕获精子细胞后,在简单的磁场力下即可对精子细胞进行富集。在精子细胞数量超过10000时,捕获效率稳定在60%以上,A-3适体功能化磁珠对精子细胞的最低检测线为100个数量级。当细胞混合液中10000/m L的精子细胞和10000/m L上皮细胞时,A-3适体功能化磁珠可以将其中64.26%的精子细胞分离出来,分离纯度超过了96%。我们采用特异性A-3适体结合磁珠建立了精子分离技术,并进一步建立以富集为特征的精子细胞检测新方法。该方法既可以用来在光学显微镜下直接检验精子细胞,也可以用来提高其他检测手段(例如下游的PCR法)的敏感性。本课题通过法医学上的实际应用,进一步验证了磁珠富集分离法的实用性。由性犯罪现场取证回来的9份精斑痕迹标本,按常规方法制备提取液。A-3适体功能化磁珠因生物素标记的A-3适体能特异捕获精斑提取液中的精子,在简单的磁场力作用下便能通过生物素-连霉亲和素作用力实现精子细胞的富集。将富集得到的精子细胞进行STR(短串联重复序列)基因座的单一男性分型。传统的差异裂解法作为对照。初步实验结果表明,差异裂解法成功得到三份精斑STR基因座的单一男性分型,磁珠分离法得到两份。其中有一份标本同时成功地被差异裂解法和磁珠分离法阳性检出,检测结果彼此一致;另有一份标本未能被差异裂解法检出,但用磁珠分离法成功地检出分型,其结果与嫌疑犯的血液标本检测结果一致。本研究通过改良的cell-SELEX方法筛选了7条抗人精子aptamer,通过荧光显微镜对混合细胞的检测证实了aptamer结合精子的特异性。其中A-3 aptamer用来进一步研究,建立了基于aptamer的精子分离法,进一步用来检测精斑。实验所用试剂和仪器简单,所用时间较传统方法大大减少,有望成为当前法医常规精斑检测法的一种互补方法,提高精子检测准确率。