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猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemmagglutinatipg encephalomyelitis virus,PHEV)及猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)均属于冠状病毒科冠状病毒属,在临床上都可引起仔猪的水样腹泻和呕吐等症状,且致死率较高,给养猪业造成严重的经济损失。越来越多的研究表明,这四种病毒在临床上常呈混合感染,为疾病的鉴别诊断带来巨大的挑战。目前,对上述病毒建立的检测方法多数是针对单一病毒,联合检测方法较少。考虑到四种病毒都是从形态学上无法区分的冠状病毒,而且感染仔猪的临床特征有一定的相似性,因此本研究从鉴别诊断方法入手,建立了可同时检测和区分四种仔猪易感冠状病毒的多重RT-PCR检测方法,并初步用于临床样本检测,对于该类病原感染的早期疫情诊断和流行病学调查具有重要意义。研究取得如下结果:根据GenBank上发表的四种冠状病毒(TGEV、PEDV、PHEV和PDCoV)的全基因序列,运用各种生物学软件对四种病毒的保守区域进行引物设计和甄选。构建该四种病毒阳性质粒。将质粒送生物公司测序,测序结果正确。通过对RT-PCR反应体系中引物浓度和退火温度的优化,分别建立了TGEV、PEDV、PHEV和PDCoV的单一RT-PCR检测方法。特异性结果为四种单一RT-PCR方法仅对目的基因有扩增,而对其他病原无扩增。TGEV、PEDV、PHEV和PDCoV单一RT-PCR的灵敏性结果可最低检测到3.28pg、0.284pg、25.7pg和0.592pg。在四种单一RT-PCR反应的基础上,逐步由单一发展到双重RT-PCR和三重RT-PCR方法。建立双重RT-PCR方法(TGEV-PEDV、TGEV-PHEV、PEDV-PHEV、TGEV-PDCoV、PEDV-PDCoV和PHEV-PDCoV)和三重RT-PCR方法(TGEV-PEDV-PHEV、TGEV-PEDV-PDCoV、TGEV-PHEV-PDCoV和PEDV-PHEV-PDCoV)并同时对退火温度进行优化。探索多对引物在同一反应中是否会因为温度的变化而产生不同的结果。结果说明,双重RT-PCR和三重RT-PCR反应中,不同温度下模板和引物不会随着引物对以及模板种类的增加而发生相互交叉反应,也不会随着温度的改变产生二聚体。以上述试验为基础,建立了同时检测四种冠状病毒TGEV、PEDV、PHEV和PDCoV的多重RT-PCR方法,并通过引物浓度和退火温度的优化,确定了最佳反应条件和反应体系。特异性结果表明,该方法能够特异性扩增目的条带。灵敏性结果表明,多重RT-PCR方法对四种冠状病毒TGEV、PEDV、PHEV和PDCoV可最低检测量分别为32.8 pg、28.4 ng、257 pg和592 pg。分别采用TGEV、PEDV、PHEV和PDCoV的单一RT-PCR和多重RT-PCR方法对42份临床样品进行检测。由结果可知,PEDV的阳性检出率最高,为42.86%。TGEV、PHEV和PDCo V的阳性检出率分别为16.67%、16.67%和0。两类RT-PCR方法相比较而言,四种病毒的符合率为100%。